發(fā)布時(shí)間：2020-04-02 01:34

【摘要】： 目的氧療是一種臨床常用治療手段,挽救了大量新生兒的生命,但可帶來(lái)由于持續(xù)用氧治療后的一種肺氧化應(yīng)激性損傷疾病-支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ)為肺泡上皮的干細(xì)胞,肺泡上皮的修復(fù)完全依賴(lài)AT-Ⅱ的增殖、分化為肺泡Ι型上皮細(xì)胞(alveolar typeⅠepithelial cell, AT-Ι)。BPD的發(fā)生發(fā)展與AT-Ⅱ增殖、存活和凋亡密切相關(guān)。而p38蛋白激酶(p38 MAP kinase, p38MAPK)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信號(hào)通路三個(gè)主要的亞家族之一,與細(xì)胞增殖、存活和凋亡密切相關(guān)。本文以體外培養(yǎng)的大鼠原代AT-Ⅱ?yàn)檠芯繉?duì)象,以不同濃度過(guò)氧化氫(H_2O_2)處理AT-Ⅱ,探討活性氧(reactive oxygen species,ROS)誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞存活、凋亡及p38MAPK對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下AT-Ⅱ修復(fù)存活,凋亡的調(diào)控作用。 方法以免疫粘附法分離純化清潔級(jí)Spraque-Dawley成年大鼠AT-Ⅱ,臺(tái)盼蘭拒染法鑒定細(xì)胞活性,改良巴氏染色法鑒定細(xì)胞純度,電鏡直接觀察AT-Ⅱ細(xì)胞形態(tài)為細(xì)胞培養(yǎng)物定性。采用過(guò)氧化氫(H_2O_2)處理模擬機(jī)體ROS攻擊AT-Ⅱ的體內(nèi)情況,建立氧化性細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(加無(wú)血清培養(yǎng)基)、H_2O_2處理組(無(wú)血清培養(yǎng)基中含10、100、500和1000μM H_2O_2)和p38MAPK干預(yù)組(加p38MAPK抑制劑SB203580)。采用倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,以四甲基偶氮唑鹽酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞存活率,Annexin-Ⅴ和PI雙染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)H_2O_2處理后AT-Ⅱ細(xì)胞磷酸化p38MAPK (Phospho-p38MAPK, p-p38MAPK)的表達(dá),并觀察p38MAPK特異性抑制劑SB203580干預(yù)后細(xì)胞存活率和凋亡率的變化及p-p38MAPK表達(dá)的變化。 結(jié)果以胰蛋白酶分離,免疫粘附法純化建立AT-Ⅱ原代培養(yǎng)的方法可收獲細(xì)胞1-2×10~7個(gè)/鼠,純度和活性90%。電鏡觀察培養(yǎng)40小時(shí)的細(xì)胞,可見(jiàn)AT-Ⅱ細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)——嗜鋨性板層小體。H_2O_2處理AT-Ⅱ180min,與對(duì)照組比較,10μM H_2O_2處理組的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異;100μM H_2O_2處理組細(xì)胞間隙稍增寬;500μM H_2O_2處理組細(xì)胞間隙增寬,貼壁細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞皺縮,胞內(nèi)可見(jiàn)空泡;1000μM H_2O_2處理組貼壁細(xì)胞數(shù)量大大減少,細(xì)胞皺縮明顯,可見(jiàn)脫壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片,同時(shí)透射電鏡下觀察到凋亡細(xì)胞的凋亡小體。MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,10μM和100μM H_2O_2攻擊AT-Ⅱ180min,細(xì)胞存活率和凋亡率與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化(P0.05),而500μM和1000μM H_2O_2攻擊AT-Ⅱ可使細(xì)胞存活率由對(duì)照組的97.50±2.588%降至80.67±6.121%和44.50±2.429%(P0.05),凋亡率由7.8960±4.4065%增至29.2420±4.2045%和48.8800±8.6261%(P 0.05)。使用p38MAPK抑制劑SB203580干預(yù)后500μMH_2O_2處理AT-Ⅱ180min,與單純500μMH_2O_2處理組比較,AT-Ⅱ貼壁細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少,細(xì)胞間隙增寬,細(xì)胞皺縮明顯,可見(jiàn)脫壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片,AT-Ⅱ存活率更加降低(P0.05)和凋亡率進(jìn)一步增高(P0.05)。另外,H_2O_2可刺激p-p38MAPK陽(yáng)性表達(dá),以刺激15min表達(dá)最強(qiáng)。p38MAPK抑制劑SB203580能有效阻斷H_2O_2刺激下p-p38MAPK的陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論 1.以胰蛋白酶分離、免疫粘附法純化建立AT-Ⅱ細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法,能夠獲得滿(mǎn)意的細(xì)胞產(chǎn)量、純度和活性,滿(mǎn)足氧化性細(xì)胞損傷模型的制備。 2. ROS可以誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞存活率下降和調(diào)亡率增加,并呈劑量依賴(lài)性。 3. p38MAPK信號(hào)通路參與了氧化應(yīng)激狀態(tài)下AT-Ⅱ細(xì)胞存活和凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的AT-Ⅱ細(xì)胞可能起到保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 8 不同濃度 H2O2對(duì) AT-Ⅱ細(xì)胞存活率的影響Fig 8 Dose-effect curve of cell’s survival ratios in H2O2-treated AT-Ⅱcells注：與對(duì)照組相較，P＜ 0.05,#與 500μM H2O2處理組比較，P＜ 0.05不同濃度 H2O2處理(ROS 攻擊)AT-Ⅱ180min 細(xì)胞凋亡式細(xì)胞術(shù)定量)照組比較，10μM 和 100μM H2O2刺激后細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化(P＞O2濃度遞增，500 μM 和 1000μM H2O2處理 AT-Ⅱ后，AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡性差異(P＜0.05)，呈劑量依賴(lài)性(表 2，，圖 9，10)。表 2 不同濃度 H2O2處理后 AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡率的變化( x ±s , n=5)Table 2 Apoptotic ratios of AT-Ⅱ cells treated by different concentration of H2O

30儀檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度 H2O2處理后 AT-Ⅱ細(xì)胞ect of apoptosis in H2O2-treated AT-Ⅱcells measure照組、10μM、100μM、500μM 和 1000μM H2O2處
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R720.597

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蔡宛如;洪輝華;駱仙芳;張弘;王新華;;芪冬活血飲對(duì)油酸致大鼠內(nèi)皮素-1水平的影響[J];浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2008年02期

2 羅真春;凌宗秀;;核轉(zhuǎn)錄因子kappa B與急性肺損傷[J];重慶醫(yī)學(xué);2006年03期

3 謝蓉,董文;核因子-κB的活化及其在急性肺損傷中的作用機(jī)制[J];福建醫(yī)藥雜志;2004年01期

4 喬凱;李宏云;楊閃閃;賈寶輝;;地塞米松對(duì)ALI/ARDS大鼠的保護(hù)作用及對(duì)糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響[J];醫(yī)藥論壇雜志;2012年04期

5 劉慶文;林春榕;吳學(xué)東;;核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與腎臟缺血-再灌注損傷[J];中外醫(yī)療;2011年09期

6 熊燕,賈汝漢;腎素-血管緊張素系統(tǒng)在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的新認(rèn)識(shí)[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2004年09期

7 吳仕平;陳明;;替米沙坦聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)糖尿病大鼠內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、功能的影響[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;2010年07期

8 陳玉君;劉唐威;陳克正;龐玉生;;前內(nèi)皮素原mRNA在新生鼠肺出血發(fā)生過(guò)程中肺內(nèi)的表達(dá)及作用[J];臨床兒科雜志;2007年10期

9 楊勇;傅曉青;董禮文;王軍;程根苗;;益氣補(bǔ)肺方對(duì)急性肺損傷大鼠ET-1和MIF水平的影響[J];浙江臨床醫(yī)學(xué);2008年04期

10 丁登峰,任永功,張雪萍;核因子-κB在急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病中的作用[J];內(nèi)科急危重癥雜志;2004年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王雪慧;通腑湯對(duì)急性肺損傷大鼠相關(guān)炎性因子及核轉(zhuǎn)錄因子κB的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2011年

2 胡澤平;替米沙坦對(duì)高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮功能的影響及其機(jī)制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

3 王雁;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶與妊高征血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2004年

4 劉松;大劑量火箭液體推進(jìn)劑吸入引起的急性肺損傷—發(fā)生機(jī)制及藥物防治研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2004年

5 周U

本文編號(hào)：2611254