【摘要】：目的構(gòu)建野生型和突變型SMARCAL1慢病毒載體,初步研究Schimke免疫-骨發(fā)育不良(SIOD)新發(fā)致病突變對(duì)SMARCAL1蛋白表達(dá)的影響。方法采集一例新確診SIOD患兒外周血樣本進(jìn)行基因測(cè)序,通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變位點(diǎn),利用蛋白質(zhì)分析軟件初步預(yù)測(cè)新發(fā)突變蛋白功能。利用PCR技術(shù)合成野生型和突變型SMARCAL1基因序列,突變型SMARCAL1基因序列包含新發(fā)突變位點(diǎn)。準(zhǔn)備載體pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO,通過(guò)酶切反應(yīng)獲得線性化載體。設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)的引物,利用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得野生型和突變型SMARCAL1基因片段。利用HB-infusion~(TM)無(wú)縫克隆試劑盒將線性化載體和目的基因片段進(jìn)行連接重組,重組質(zhì)粒產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞DH5α懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)化,挑取平板單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定,選取陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子測(cè)序分析。分別對(duì)序列正確的野生型重組轉(zhuǎn)化子和突變型重組轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒抽提,抽提的質(zhì)粒與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共同感染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)兩次收集病毒上清,超速離心純化,測(cè)定病毒滴度后分裝保存。傳代培養(yǎng)HEK293細(xì)胞,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索慢病毒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞最適Polybrene濃度和最適MOI值。分別用空載型、野生型和突變型慢病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,用適宜濃度的嘌呤霉素連續(xù)篩選并傳3代,得到三組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。分別提取正常HEK293細(xì)胞及空載型、野生型、突變型穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的總蛋白,利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)四組細(xì)胞中SMARCAL1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果SIOD患兒基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SMARCAL1基因(NM_014140.3)Exon5:c.1071delT;p(Phe357fs)。該突變?yōu)橐拼a突變,蛋白質(zhì)分析軟件預(yù)測(cè)為有害,預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致SMARCAL1基因所編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生截短從而影響其正常生物功能。HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)該突變的相關(guān)報(bào)道,且ESP6500siv2_ALL、千人基因組和dbSNP147等數(shù)據(jù)庫(kù)均未見(jiàn)收錄。通過(guò)分別對(duì)野生型和突變型陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子測(cè)序,并分析比對(duì)野生型和突變型SMARCAL1基因片段序列,證實(shí)與野生型、突變型目標(biāo)區(qū)序列一致,提示成功構(gòu)建野生型和突變型SMARCAL1過(guò)表達(dá)慢病毒載體。慢病毒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)后,在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,提示轉(zhuǎn)染成功。Western Blot結(jié)果顯示:突變組SMARCAL1蛋白表達(dá)水平明顯低于野生組、正常組和空載組,P0.05;提示新發(fā)突變?cè)斐蒘MARCAL1蛋白表達(dá)減少。結(jié)論患兒外周血基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SMARCAL1新發(fā)移碼突變,蛋白質(zhì)分析軟件預(yù)測(cè)該移碼突變會(huì)導(dǎo)致SMARCAL1基因所編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生截短從而影響其正常生物功能。成功構(gòu)建了野生型和突變型SMARCAL1過(guò)表達(dá)慢病毒載體,用于后續(xù)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。成功轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,獲得野生型和突變型SMARCAL1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。Western Blot證實(shí)SMARCAL1新發(fā)突變?yōu)镾IOD致病突變。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)方法（2）純化：將收集到 50 mL 離心管中的病毒上清，4℃，2000×g 離心 10細(xì)胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速離心管中，4℃，82700×g 離，將得到的慢病毒超離液分裝到滅菌處理的病毒管中。標(biāo)記病毒名稱及年-80℃冰箱保存。2.4.5 慢病毒滴度測(cè)定（1）細(xì)胞準(zhǔn)備：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 293T 細(xì)胞消化重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后加稀釋至 1×105/ml,每孔 100μl 鋪入 96 孔板，即每孔約 1×104個(gè)細(xì)胞，每種，做好標(biāo)記。置 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。（2）第一天：在 EP 管中做 10 倍梯度稀釋，連續(xù) 6 個(gè)稀釋度。稀釋方毒準(zhǔn)備 6 個(gè) 1.5mlEP 管，每管加 90μl 完全培養(yǎng)基，往管 1 中加入 10μl 勻后吸取 10μl 加入管 2 中混勻。以此類推如圖 2。然后把每種病毒稀毒液分別加入對(duì)應(yīng)的 6 個(gè)孔中與細(xì)胞 37℃孵育過(guò)夜。

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果1 野生型和突變型 SMARCAL1 過(guò)表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果經(jīng)限制性內(nèi)切酶線性化載體與目的基因擴(kuò)增片段，，通過(guò)重組反應(yīng)進(jìn)行體外環(huán)化。重組的目的基因質(zhì)粒載體經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑選單克隆菌落進(jìn)行 PCR 鑒定，得到陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子。通過(guò)分別對(duì)野生型和突變型陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子測(cè)序（結(jié)果見(jiàn)圖 3-4），并分析比對(duì)野生型和突變型 SMARCAL1 基因片段序列（結(jié)果見(jiàn)圖 5-6），證實(shí)與野生型、突變型目標(biāo)區(qū)序列一致。說(shuō)明成功構(gòu)建野生型和突變型 SMARCAL1 重組質(zhì)粒載體，可用于下一步慢病毒包裝。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R726.8

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本文編號(hào)：2598954