【摘要】：先天性心臟病(Congenital heart disease,CHD)是胚胎發(fā)育時期由于心管扭曲成袢異常,或出生后應自動關閉的通道未能閉合而引起的心臟解剖結構異常,是新生兒最常見的出生缺陷,也是全球范圍內(nèi)嬰幼兒死亡的主要原因之一。流行病學資料顯示,先天性心臟病的出生患病率約為0.6%~1.2%。先天性心臟病的主要類型有室間隔缺損(Ventricular septal defects,VSDs)、房間隔缺損(Atrial septal defects,ASDs)、房室間隔缺損(atrioventricular septal defect,AVSD)、動脈導管未閉(Patent ductus arteriosus,PDA)、法洛四聯(lián)癥(Tetralogy of Fallot,TOF)、右心室雙向流出道(Right ventricular outflow tract,RVOT)等。法洛四聯(lián)癥是最嚴重的紫紺型先天性心臟病之一,是由于胚胎時期圓錐動脈干發(fā)育異常所致,在新生兒中出生患病率約為1/3000,占到所有先天性心臟病的5%。隨著先進醫(yī)療技術的發(fā)展,TOF的早期致死率并不高,但患者會伴有長期的后遺癥,如心率不齊、心室功能性障礙甚至導致終生的殘疾。先天性心臟病的病因復雜,一般認為與遺傳因素和環(huán)境因素相關。環(huán)境因素主要是母親孕期暴露,包括有害環(huán)境暴露,藥物暴露,營養(yǎng)因素等。大量的遺傳學研究已證實先天性心臟病的發(fā)生與遺傳因素有關,主要包括染色體異常、單基因遺傳缺陷、多基因缺陷、拷貝數(shù)變異等。法洛四聯(lián)癥作為最常見的紫紺型先天性心臟病,遺傳致病原因多種多樣,染色體異常包括染色體22q11.2缺失(DiGeorge綜合癥)和21三體(Down綜合癥)等,分別占法洛四聯(lián)癥發(fā)病率的15%和7%。TBX1,NKX2-5,GATA4,ZFPM2,GATA6,GDF1,JAG1等單個基因的變異都會引起法洛四聯(lián)癥。然而大部分法洛四聯(lián)癥患者的遺傳病因并不明確。以往研究多針對基因的編碼區(qū)域,而目前大量研究報道了遠端調控元件中非編碼突變導致疾病發(fā)生,例如,Smemo S等~([1])通過基因組學,生物信息學和小鼠基因工程結合,證明TBX5增強子中的非編碼突變可能引起與TBX5功能障礙相關的CHD。Sankaran VG等對在β-珠蛋白基因座上有異常缺失的3個家系進行研究,鑒定出一個胎兒血紅蛋白(基因)沉默所必需的靠近δ-珠蛋白基因的基因間區(qū)域。但是非編碼變異在人類復雜疾病(包括先天性心臟病)中的潛在作用仍然知之甚少。隨著Roadmap表觀基因組學項目(Epigenomics Roadmap Project)和DNA元件百科全書計劃(Encyclopedia of DNA Elements,ENCODE)等大型非編碼區(qū)研究項目的開展,非編碼區(qū)域突變受到越來越多的關注。自人類基因組計劃完成以來,二代測序技術飛速發(fā)展,通過借助全基因組測序技術和生物信息學工具,可以最大程度地利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)研究法洛四聯(lián)癥新的致病基因和致病位點,從而更深層次地揭示法洛四聯(lián)癥的分子機制。本課題對兩個單純型法洛四聯(lián)癥核心家系(兩個非患病父母和一個患病孩子)成員進行了全基因組測序(whole genome sequencing,WGS),測序數(shù)據(jù)使用針對編碼區(qū)突變,調控元件中非編碼區(qū)突變以及復合雜合突變的致病變異篩選流程,嘗試探索單純型法洛四聯(lián)癥患者的遺傳學病因。通過多個數(shù)據(jù)庫和軟件分析注釋編碼突變(包括新生和遺傳性突變),以及調控元件中的非編碼突變。發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)不存在滿足美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(American Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南標準的致病性突變(第一類突變)。我們將其余預測為潛在有害的編碼突變歸為一類用于后續(xù)研究(第二類突變),并且基于積分法預測調控元件(IM-PET)方法得到的調控元件數(shù)據(jù)庫,在非編碼區(qū)鑒定了位于調控元件中的潛在有害突變,隨后把相同基因上的復合雜合突變歸為一類(第三類突變)。使用ToppGene軟件對復合雜合突變所在目標基因進行優(yōu)先排序,最終在先證者中鑒定了位于優(yōu)先基因上的可能致病編碼突變和非編碼突變組合的復合雜合模式。在先證者P1中,檢測到NOTCH1外顯子及其調控元件中的雙等位基因突變(chr9:g.139409115AT,p.Asn685Ile;chr9:g.13944949 CA)分別遺傳自先證者的父母。在先證者P2中發(fā)現(xiàn)與P1類似的遺傳模式,鑒定了可能調控FN1基因功能的復合雜合突變(chr2:216235029CT,p.Val2281Met;chr2:g.2166525154AC),分別位于FN1基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。NOTCH1是已發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典先天性心臟病病致病基因。我們通過CRISPR/Cas9基因編輯技術,熒光素酶報告基因等體外功能實驗,進一步驗證NOTCH1潛在調控元件及其調控區(qū)域內(nèi)相應非編碼突變的功能效應。CRISPR/Cas9基因編輯實驗結果表明,在NOTCH1非編碼區(qū)域雜合敲除(Region~(+/-))和純合敲除(Region~(-/-))的HEK293T細胞克隆中,NOTCH1基因的表達顯著高于野生型克隆(Region~(+/+)),表明這個潛在調控區(qū)域發(fā)揮沉默子的功能。并且純合敲除克隆(Region~(-/-))中的NOTCH1表達最高,說明存在一定的劑量敏感效應。熒光素酶報告基因檢測結果顯示,攜帶非編碼突變序列的質粒熒光素酶活性水平顯著低于野生型,表明調控元件上的非編碼突變增加了沉默子的活性,導致NOTCH1的表達進一步降低。結合CRISPR/Cas9敲除結果得出結論,沉默子區(qū)域的非編碼突變降低了NOTCH1的表達。綜上所述,本研究通過對兩個單純型TOF家系進行全基因組測序,對編碼區(qū)和非編碼功能區(qū)變異進行注釋和篩選,嘗試探索了調控元件中非編碼突變和編碼突變的復合雜合遺傳模式與TOF發(fā)病的關系,并且通過體外實驗證實了該非編碼區(qū)域和相應突變的功能效應。結果表明,這種復合雜合突變可以增加TOF的外顯率,本研究結果為TOF遺傳結構研究提供了新的線索。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學碩士學位論文值對候選基因進行排序，，最終確定先證者最優(yōu)先致病基因和致病突變。先前已報道了 6 個明確的 TOF（OMIM＃187500）致病基因: GATA6，GDF1，JAG1，NKX2-5，TBX1，ZFPM2[42]，我們將這 6 個基因列為訓練集基因，使用ToppGene 基于訓練集基因的功能相似性對先證者的目標候選基因進行識別和優(yōu)先排序。本研究使用的 ToppGene 訓練參數(shù)設置為：GO: molecular function, GO:biological process, GO: cellular component, human phenotype, mouse phenotype,pathway, PubMed, disease 的 FDR 校正 P 值臨界值 0.05，gene limits 1-2,000，檢測參數(shù)設置為默認值。篩選致病變異分析流程如圖 1 所示。

17圖 2. CRISPR/Cas9 區(qū)域敲除該圖顯示 CRISPR/Cas9 敲除系統(tǒng)的基因組編輯結果。A：敲除區(qū)域和非編碼突變位置，以及CRISPR/Cas9 敲除系統(tǒng)的示意圖。B：凝膠電泳檢測不同克隆中基因編輯結果。C：Sanger測序驗證基因組序列，包括純合克隆的反義序列。2.2.10 細胞 RNA 提取和質檢通過 TRIzol LS 試劑從 HEK293T 細胞中提取總 RNA。具體實驗步驟如下：（1）收集 HEK293T 細胞，胰酶消化，3000×g 離心 5min，PBS 洗滌兩次。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R725.4

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 趙靜;龔曉玲;周芳;;小兒法洛四聯(lián)癥圍術期護理研究[J];人人健康;2017年12期

2 李瑞冰;郭立新;霍毅中;;法洛四聯(lián)癥術后急性呼吸窘迫綜合征治療體會(附5例報告)[J];北京醫(yī)學;2013年01期

3 田會英;;法洛四聯(lián)癥患兒圍術期護理[J];醫(yī)學理論與實踐;2011年01期

4 孫雪峰;趙冬梅;張秀和;張伯民;姜亦忠;;112例法洛四聯(lián)癥臨床分析[J];中國實驗診斷學;2011年08期

5 黃擊修;劉健;林小彬;付建;劉勇;;外科治療法洛四聯(lián)癥47例臨床分析[J];中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志;2008年07期

6 何振波;張福維;梁友君;李東濤;高軍;劉成昌;;外科治療法洛四聯(lián)癥33例臨床體會[J];中國心血管病研究;2007年10期

7 梁小玉;馬曉玲;季康玉;;法洛四聯(lián)癥術中監(jiān)測指標的觀察與護理配合[J];全科醫(yī)學臨床與教育;2006年02期

8 葉建明,吳康康,譚海棟;法洛四聯(lián)癥合并完全性肺靜脈異位引流1例[J];中華胸心血管外科雜志;2004年06期

9 張冉,郭斌,徐樹彬,鮑玫,李萍,楊杰;法洛四聯(lián)癥合并完全性肺靜脈異位引流一例[J];中國胸心血管外科臨床雜志;2004年04期

10 林慧,陸X;完全性心內(nèi)膜墊缺損合并法洛四聯(lián)癥 1例[J];汕頭大學醫(yī)學院學報;2001年03期

相關會議論文 前10條

1 胡型銻;趙琦峰;吳國偉;杜杰;費建斌;項建文;鄭彬彬;;一歲以下小兒法洛四聯(lián)癥外科根治術(摘要)[A];2014年浙江省醫(yī)學會小兒外科學分會心胸外科學組學術年會論文匯編[C];2014年

2 劉宏宇;張學鋒;王柏春;李春雨;;成人法洛四聯(lián)癥側支循環(huán)的處理[A];中國心臟大會（CHC）2011暨北京國際心血管病論壇論文集[C];2011年

3 劉迎龍;;右外側小切口矯治法洛四聯(lián)癥[A];2012年浙江省醫(yī)學會小兒外科學分會心胸外科學組學術會議暨浙江省先天性心臟病高峰論壇論文集[C];2012年

4 喻本桐;劉季春;萬于華;饒華庚;;成人法洛四聯(lián)癥的外科治療[A];第八屆華東六省一市胸心血管外科學術會議論文匯編[C];2005年

5 范慶浩;鄭雪梅;黃國金;吳俊;朱雄凱;;小兒法洛四聯(lián)癥外科治療19例[A];2006年浙江省胸心外科學術會議論文匯編[C];2006年

6 劉季春;喻本桐;萬于華;饒華庚;吳起才;劉升;;法洛四聯(lián)癥的外科治療[A];中華醫(yī)學會第七次全國胸心血管外科學術會議暨2007中華醫(yī)學會胸心血管外科青年醫(yī)師論壇論文集心血管外科分冊[C];2007年

7 胡型銻;趙琦峰;吳國偉;杜杰;費建斌;;1歲以內(nèi)法洛四聯(lián)癥外科根治術[A];2008年浙江省胸心外科學學術年會暨浙江省醫(yī)學會胸心外科學分會體外循環(huán)學組、胸腔鏡學組成立大會論文匯編[C];2008年

8 石開虎;龔文輝;張飛;徐盛松;宣海洋;曹煒;趙旭東;;成人和小兒法洛四聯(lián)癥外科治療[A];中國心臟大會（CHC）2011暨北京國際心血管病論壇論文集[C];2011年

9 胡型銻;趙琦峰;吳國偉;杜杰;費建斌;;嬰兒法洛四聯(lián)癥外科根治術[A];2012年浙江省醫(yī)學會小兒外科學分會心胸外科學組學術會議暨浙江省先天性心臟病高峰論壇論文集[C];2012年

10 喬彬;吳莉莉;王同建;張鋒泉;寧巖松;王春艷;朱萌;郭寧;康霞;孫華梅;;小嬰兒法洛四聯(lián)癥一期糾治經(jīng)驗[A];第八屆華東六省一市胸心血管外科學術會議論文匯編[C];2005年

相關重要報紙文章 前1條

1 清華大學第一附屬醫(yī)院心臟中心 張東亞 博士 邢穎 副主任醫(yī)師;兒童法洛四聯(lián)癥要盡早手術[N];保健時報;2007年

相關博士學位論文 前10條

1 李洪波;BMP4和DPF3在法洛四聯(lián)癥發(fā)生中對心肌細胞分化作用機制的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2017年

2 楊曉菲;TBX20基因啟動子區(qū)甲基化在法洛四聯(lián)癥中的致病機制研究[D];山東大學;2018年

3 汪泉;HA117調控DPF3在法洛四聯(lián)癥發(fā)生中對心肌細胞分化作用機制的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2018年

4 孫強;吸入NO對法洛四聯(lián)癥矯治術后血流動力學的影響[D];山東大學;2006年

5 孫國林;法洛四聯(lián)癥圍術期磁共振波譜代謝組學研究[D];第三軍醫(yī)大學;2013年

6 葉菁菁;無創(chuàng)評估法洛四聯(lián)癥患兒右心室功能的探討[D];浙江大學;2010年

7 盛偉;法洛四聯(lián)癥患者心肌組織基因甲基化變異及機制研究[D];復旦大學;2012年

8 王琦光;法洛四聯(lián)癥患者Nkx2.5、ISLet1和MTHFR基因篩查[D];第四軍醫(yī)大學;2014年

9 李玉曼;超聲斑點追蹤成像技術評價法洛四聯(lián)癥患者手術前后右室局部心肌及整體功能的臨床應用研究[D];華中科技大學;2011年

10 陳月芹;雙源CT前門控大螺距掃描在小兒法洛四聯(lián)癥診斷中的應用研究[D];青島大學;2016年

相關碩士學位論文 前10條

1 蔣祝;NOTCH1復合雜合與法洛四聯(lián)癥關系的探索研究[D];南京醫(yī)科大學;2019年

2 李華民;三維重建與3D打印技術在法洛四聯(lián)癥診療中的應用[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學院;2018年

3 李偉;16層螺旋CT和超聲心動圖在兒童先天性法洛四聯(lián)癥心血管成像中的應用[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學院;2014年

4 時宇博;成人法洛四聯(lián)癥根治術的臨床分析[D];中南大學;2011年

5 蔣林哲;法洛氏四聯(lián)癥根治術后心臟重構、左心室功能及血液動力學變化的研究[D];延邊大學;2007年

6 曾嘉航;嬰兒期法洛四聯(lián)癥一期根治術手術時機的選擇[D];廣州醫(yī)學院;2011年

7 司彪;雙源CT評價嬰幼兒先天性心臟病肺動脈的應用探討[D];山東大學;2010年

8 宋國棟;法洛四聯(lián)癥心肌纖維結構變化與右室流出道—肺動脈壓差關系的研究[D];山東大學;2008年

9 羅磊;低體重兒童法樂氏四聯(lián)癥根治術高危因素分析[D];新疆醫(yī)科大學;2012年

10 朱子夫;ALDH2基因多態(tài)性與法洛四聯(lián)癥患者術后心功能恢復相關性研究[D];昆明醫(yī)學院;2011年

本文編號：2596103