發(fā)布時間：2020-02-17 14:49

【摘要】：第一部分神經肽P物質對95%氧致AECⅡ細胞損傷的氧化抗氧化作用 背景 在新出生的早產兒中，由于機械通氣反復過度擴張肺泡和肺泡導管，吸入高濃度氧氣產生大量ROS，從而引起肺氧化應激性損傷。肺泡上皮細胞是氧化應激性損傷的主要作用位點，由于肺泡型上皮細胞（AEC）已經高度分化，失去再生能力,因此肺泡上皮的修復完全依靠肺泡型上皮細胞（AECⅡ）的增殖轉分化，而高氧暴露會抑制AECⅡ細胞的增殖，促進AECⅡ細胞凋亡，導致肺損傷修復困難或出現(xiàn)纖維化等異常修復。 神經肽P物質（SP）是由多個氨基酸組成的感覺神經肽，具有廣泛的生物學作用。有研究發(fā)現(xiàn)，SP在心肌缺血、燒傷等引起的肺損傷中會引起氣道炎癥反應，但亦有研究發(fā)現(xiàn)，SP可刺激上皮細胞生長因子及受體表達，調控表皮干細胞遷移、分化，進而促進上皮損傷修復。但目前，SP在高氧肺損傷中的氧化及抗氧化作用鮮有報道。 目的 （1）采用改良后的差異貼壁法分離培養(yǎng)19d早產鼠AECⅡ并鑒定，為后續(xù)建立SP干預細胞氧化損傷模型奠定基礎。 （2）研究SP干預對高氧暴露下AECⅡ細胞的影響，探討SP在高氧肺損傷中氧化及抗氧化的作用。 方法 分離培養(yǎng)、純化SPF區(qū)孕19d大鼠的AECⅡ，經改良巴氏染色鑒定細胞純度，透射電鏡鑒定細胞后，放入細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)24h后，按照隨機分組原則分為：1、空氣組：細胞放入培養(yǎng)箱中，其中氧體積分數(shù)為21%（21%濃度氧）；2、高氧組：細胞放入含有95%O_2和5%CO_2的混合氣體的密閉氧倉中；3、高氧SP組：細胞培養(yǎng)液中預先加入5×10~(-8)mol/L的SP，再行高氧處理；4、高氧SP受體拮抗劑組：細胞培養(yǎng)液中預先加入5×10~(-8)mol/L SP和5×10~(-7)mol/LSP受體拮抗劑L703.606，其余處理同高氧組。各組細胞均置于5%CO_2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。 （1）光學顯微鏡觀察細胞的生長狀況。 （2）激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞的超氧化物陰離子水平表達情況。 （3）流式細胞儀檢測各組細胞內線粒體膜電位水平。 （4）通過流式細胞儀檢測細胞周期。 （5）化學比色法測定各組細胞內MDA、TAOC、SOD含量。 結果 與空氣組比較，高氧組暴露24h，倒置顯微鏡下觀察AECⅡ明顯收縮，細胞間隙增大，部分細胞脫壁，細胞存活率和線粒體膜電位水平明顯下降， ROS含量明顯增加，超氧化物陰離子水平和凋亡率明顯升高（P＜0.05）。進一步檢測細胞氧化損傷指標可見細胞內MDA水平升高，而TAOC、SOD含量下降（P＜0.05）。SP干預后與高氧組比較形態(tài)學觀察可見細胞外形與空氣組接近，細胞收縮減輕，存活率和線粒體膜電位水平明顯升高，ROS含量明顯減少，超氧化物陰離子水平和凋亡率明顯下降，氧化損傷指標MDA水平下降，而TAOC、SOD含量升高（P＜0.05）。但是，L703.606干預后SP的氧化抗氧化作用明顯降低，細胞氧化損傷與SP干預處理組比較明顯增加（P＜0.05）。結論 SP干預后可顯著降低高氧暴露下AECⅡ的凋亡，改善高氧對AECⅡ的增殖抑制，減輕高氧對AECⅡ的氧化損傷，增強細胞的抗氧化能力。SP對高氧致AECⅡ損傷的保護作用同改善AECⅡ氧化/抗氧化失衡有關。 第二部分Wnt信號在神經肽P物質對95%氧致AECⅡ細胞氧化抗氧化作用的機制研究 背景 Wnt信號通路是一種非常經典的信號轉導通路，在各種生物體內發(fā)揮重要作用，可以調控胚胎生長發(fā)育、細胞增殖分化及凋亡等。很多疾病的發(fā)病機制都與Wnt信號通路的失活有關。其中Wnt經典信號通路在肺發(fā)育、肺泡上皮細胞的增殖分化以及肺的空間構象形成中發(fā)揮重要作用。當Wnt信號被激活時，Wnt蛋白與Dally、FRPs蛋白結合，該蛋白復合體與細胞表面受體Frizzled/LRP結合，引起細胞胞漿內β-catenin積聚，轉移入核內，調控下游靶基因的表達。 前一部分已經證明SP干預后可顯著減輕高氧對AECⅡ的氧化損傷，增強細胞的抗氧化能力。SP對高氧致AECⅡ損傷的保護作用同改善AECⅡ氧化/抗氧化失衡有關。然而SP是否通過激活Wnt經典信號通路發(fā)揮氧化抗氧化作用，目前國內外無相關研究報道。本實驗部分主要探討AECⅡ細胞核內Wnt經典信號通路在空氣、高氧環(huán)境及SP、SP受體拮抗劑干預后的表達情況，進一步探討B(tài)PD的發(fā)病機制。 目的 探討SP干預對高氧暴露下AECⅡ的氧化抗氧化作用是否與活化Wnt經典信號通路有關，觀察該信號通路中Wnt7b和β-catenin信號分子的變化。 方法 (1)分離培養(yǎng)孕19d的早產鼠AECⅡ細胞并建立細胞氧化損傷模型。 (2)RT-PCR檢測高氧暴露及SP干預后細胞內Wnt信號通路中Wnt7b和β-catenin基因表達水平。 (3)Western Blot檢測高氧暴露及SP干預后細胞內Wnt信號通路中Wnt7b和β-catenin蛋白表達水平。 結果 高氧暴露24小時后，AECⅡ內Wnt7b和β-catenin信號分子的mRNA和蛋白表達水平明顯減弱，與空氣組比較有顯著性差異（P＜0.05）。而高氧暴露前給予SP干預后，Wnt7b和β-catenin的mRNA和蛋白水平有所增加（P＜0.05），，表明SP可激活Wnt經典信號通路。而SP拮抗劑L703.606干預后，Wnt7b和β-catenin的mRNA和蛋白水平均有所下降（P＜0.05），表明Wnt經典信號通路的激活可被抑制。 結論 高氧暴露后AECⅡ內Wnt經典信號通路發(fā)生了變化， SP對細胞損傷的氧化抗氧化作用可能與激活Wnt經典信號通路有關。
【圖文】：

圖 1.1：光學顯微鏡觀察 AECⅡ細胞形態(tài)圖 1.2：電鏡觀察 AECⅡ形態(tài)Fig1.1: Cell morphology of AECⅡ(×200)Fig1.2: AEC Ⅱmorphou by Electron（×8000）圖 1.3：改良巴氏染色 (×400)Fig1.3：Modified Papanicolaou stain forstaining inclusions in AECⅡ cells (×400)

圖 1.1：光學顯微鏡觀察 AECⅡ細胞形態(tài)圖 1.2：電鏡觀察 AECⅡ形態(tài)Fig1.1: Cell morphology of AECⅡ(×200)Fig1.2: AEC Ⅱmorphou by Electron（×8000）圖 1.3：改良巴氏染色 (×400)Fig1.3：Modified Papanicolaou stain forstaining inclusions in AECⅡ cells (×400)
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R722.6

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 黃波;付紅敏;楊鳴;方芳;匡鳳梧;許峰;;高氧對早產鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響及神經肽P物質的保護作用[J];第三軍醫(yī)大學學報;2008年24期

2 王少華;許峰;黨紅星;;降鈣素基因相關肽對高氧暴露胎鼠原代肺泡Ⅱ型細胞的保護作用及其Wnt信號機制[J];第三軍醫(yī)大學學報;2012年09期

3 楊林;黨紅星;劉聰;方芳;許峰;;神經肽P物質對高氧暴露下肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響及其對信號分子Gli1的調控[J];重慶醫(yī)學;2012年24期

4 楊保林,武維屏,王碩仁,任傳云;心理應激對哮喘大鼠肺內神經肽及NK1受體mRNA表達的影響[J];中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志;2004年04期

本文編號：2580433