發(fā)布時間：2020-01-23 11:58

【摘要】：背景：支氣管哮喘作為一種常見疾病，在兒童期間發(fā)病率在世界范圍內(nèi)有逐漸上升的趨勢。兒童哮喘與成人哮喘具有同樣的病理生理基礎(chǔ)，但由于兒童處于生長發(fā)育階段，因此具有其自身的特點。小兒氣道炎癥也會隨年齡增長而發(fā)生變化，最終約2/3患兒疾病自然緩解、癥狀消失，另外1/3左右患兒病情持續(xù)、發(fā)展為成人哮喘。兒童哮喘這種隨年齡變化而呈現(xiàn)的不同自然病程及預(yù)后轉(zhuǎn)歸現(xiàn)象目前都還沒有合理的解釋，其自然病程演變規(guī)律及機制還不清楚，然而疾病的自限性和進展性的差異提示它們存在本質(zhì)上的不同。目前，臨床上通常以臨床癥狀、肺功能及治療效果來衡量哮喘輕重及控制情況，但絕大多數(shù)穩(wěn)定期哮喘患兒肺功能正常。研究表明即使部分患兒肺功能正常，其仍持續(xù)存在小氣道慢性炎癥，而該種慢性炎癥的持續(xù)存在是導(dǎo)致兒童哮喘反復(fù)發(fā)作和病情進展導(dǎo)致控制不良的基礎(chǔ)。因而肺功能是評估兒童哮喘病情不夠敏感的指標(biāo)。早期明確哮喘患兒病情嚴(yán)重程度及其轉(zhuǎn)歸方向?qū)χ笇?dǎo)兒童哮喘治療和減輕家長及患兒心理負擔(dān)有重要意義。但目前臨床上缺乏能夠準(zhǔn)確評估哮喘病情及預(yù)后的客觀指標(biāo)，更缺少針對兒童哮喘病情及預(yù)后評估的前瞻性的研究。疾病相關(guān)的生物靶標(biāo)（biomarker）可提示疾病相關(guān)信息，可用于疾病的輔助診斷、病情進展的監(jiān)測和預(yù)后及疾病的預(yù)防。目前關(guān)于兒童哮喘的生物靶標(biāo)研究還很局限，因此，急需新興的生物靶標(biāo)來輔助客觀地評估兒童哮喘。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)，為哮喘生物靶標(biāo)的篩選提供了新的希望。采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選疾病相關(guān)的蛋白靶標(biāo)，可發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的系列蛋白靶標(biāo)及潛在藥物靶標(biāo)，還可發(fā)現(xiàn)目前沒有同疾病相關(guān)聯(lián)的新蛋白。 目的：篩選潛在用于評估兒童哮喘病情及預(yù)后的蛋白靶標(biāo)。 方法：通過使用二維差異凝膠電泳技術(shù)（two dimensional differential in-gelelectrophoresis，2D-DIGE），分離及篩選不同輕重程度穩(wěn)定期哮喘兒童（根據(jù)GINA方案，間歇發(fā)作、輕度持續(xù)、中度持續(xù)、重度持續(xù)組）及健康兒童血漿蛋白，進一步經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time offlight-mass spectrometry，MALDITOF/TOF MS）鑒定，然后經(jīng)ELISA方法進行另一擴大人群臨床驗證試驗，明確各蛋白靶標(biāo)在病情輕重不同組別的分布規(guī)律，篩選評估兒童哮喘病情輕重的蛋白靶標(biāo)（候選蛋白靶標(biāo)多組間比較統(tǒng)計分析采用單因素方差分析）；同時對哮喘兒童進行為期3年的隊列研究，根據(jù)其轉(zhuǎn)歸情況（完全緩解、好轉(zhuǎn)、持續(xù)、進展），再次行血ELISA靶標(biāo)檢測，分別分析入組初及3年隨訪后的個體候選靶標(biāo)表達水平及其隨訪前后的蛋白靶標(biāo)水平的差值，分別按照轉(zhuǎn)歸分組進行多組間比較的單因素方差分析，篩選評估兒童哮喘預(yù)后的蛋白靶標(biāo)。 結(jié)果:通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，組間共篩選出36個差異蛋白（p0.05），20個蛋白點經(jīng)質(zhì)譜鑒定，代表了8種蛋白（同種蛋白由于同型異構(gòu)體的分子量或等電點的不同可出現(xiàn)在凝膠的不同位置），其中4個蛋白靶標(biāo)經(jīng)擴大人群ELISA試驗驗證，在組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義，分別為抗凝血酶III （antithrombin-III， AT-III）、 α2巨球蛋白（alpha2-macroglobulin，A2M）、CD5L（CD5antigen-like, CD5L）、補體C3（Complement3,C3）。在穩(wěn)定期兒童哮喘與對照組間比較，AT-III在哮喘組表達明顯高于對照組（p0.01）；C3、A2M在對照組高于哮喘組（p0.05）；在穩(wěn)定期哮喘組內(nèi)比較差異有顯著性，AT-III隨病情加重表達有升高趨勢（ANOVAp0.05），CD5L、A2M隨病情加重表達有逐漸下降的趨勢（ANOVA,p0.05, p0.01），其中AT-III與A2M呈負相關(guān)（r=-0.259，p0.05）,與CD5L呈負相關(guān)（r=-0.276，p0.05）,與FEV1%/FVC%呈負相關(guān)（-0.362，p0.05）；CD5L與A2M之間呈正相關(guān)（r=0.303, p0.01），與FEV1%/FVC%呈正相關(guān)（r=0.264，p0.05）。隊列研究中（3年隨訪前后）各轉(zhuǎn)歸組間比較，CD5L表達在入組時（CD5L前）各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.05），隨轉(zhuǎn)歸加重其表達下降。在隨訪結(jié)束時（CD5L后）其表達在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.01），隨轉(zhuǎn)歸加重其表達下降。CD5L差值（CD5后－CD5前）在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.05），在加重及持續(xù)組其差值下降高于健康對照；AT-III前及AT-III后在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別無顯著性，但其表達隨轉(zhuǎn)歸加重由升高趨勢。AT-III差值在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.05），在好轉(zhuǎn)組其差值降低高于持續(xù)、加重組及健康對照組；A2M前在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.05），健康對照組與完全緩解組及加重組間存在差異，A2M后在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別無顯著性，A2M前及A2M后其表達隨轉(zhuǎn)歸變化無明顯趨勢。A2M差值在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別無顯著性；補體C3前、補體C3后及補體C3差值在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別皆無顯著性，其隨轉(zhuǎn)歸變化無明顯趨勢。 結(jié)論:本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了兒童哮喘評估病情及預(yù)后的相關(guān)系列蛋白靶標(biāo)。AT-III、A2M、補體C3可輔助診斷兒童哮喘；AT-III、A2M、CD5L與兒童哮喘疾病嚴(yán)重相關(guān)，AT-III、CD5L與兒童哮喘預(yù)后轉(zhuǎn)歸相關(guān)。血漿蛋白靶標(biāo)AT-III、A2M、CD5L、補體C3有望作為輔助兒童哮喘診斷及評估疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的有力工具。
【圖文】：

行 3 年的縱向隨訪（包括對其候選血漿蛋白靶標(biāo)的動態(tài)檢測），針對哮喘歸類型，分析其血漿標(biāo)志物表達的動態(tài)變化，來尋找與兒童哮喘疾病不同列蛋白靶標(biāo)。1）參選對象管理流程圖：究對象入組（納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，簽署知情同意）--- 建立基本信息檔案 --檢查 --- 按 GINA 方案評估病情分組、治療 --- 門診隨訪（每 3 個月 1隨訪結(jié)束，重新評估病情分組，采血。2）蛋白質(zhì)組學(xué)實驗流程圖：漿標(biāo)本（包括穩(wěn)定期哮喘兒童間歇、輕度、中度、重度及健康對照，加酶存）--- 去除高豐度蛋白（IgY14 免疫親和柱）--- 除鹽，定量 --- 雙相凝蛋白篩選） --- 候選蛋白靶標(biāo) --- 質(zhì)譜分析（MALDI-TOF/TOF MSMS）體見圖 1.1。

、手工刪除非蛋白點，凝膠間蛋白點的匹配分析。通過進行膠內(nèi)檢白點的數(shù)量（多數(shù)約 2000 個點左右）、定位及編號以及蛋白點的相動或手動執(zhí)行確定最佳靈敏度，（靈敏度過高會增加入選非蛋白點掉真正的蛋白點。）然后進行消除背景，通過調(diào)節(jié)要消除背景的大空間分析范圍。然后進行蛋白點歸一化處理，通過內(nèi)標(biāo)匹配的蛋白別蛋白點最多的膠為主膠（即 Master 膠），，進而與其他凝膠圖像進行手工刪除非典型蛋白點和雜質(zhì)造成的“假點”。接下來在 DeCyder-BV間匹配明確的蛋白點盡量先進行人工匹配，然后啟動 BVA 軟件自動膠與主膠之間的匹配。當(dāng)所有蛋白點匹配工作完成后，軟件可自動達量的差異進行統(tǒng)計學(xué)分析（t 檢驗），通過設(shè)置有意義蛋白表達量會自動提供出差異有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白點編號。PH4-7
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R725.6;R3411

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳育智;;兒童哮喘防治近況[J];華中醫(yī)學(xué)雜志;2006年04期

2 王好典;陳慧中;張霆;員聰敏;李克偉;陳晨;李俊玲;錢淵;;356例兒童支氣管哮喘5年隨訪觀察[J];臨床兒科雜志;2009年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉瑩;氧化應(yīng)激對內(nèi)皮祖細胞作用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];吉林大學(xué);2012年

本文編號：2572271