【摘要】：目的明確1例肝腎發(fā)育異常患兒的遺傳學(xué)病因。方法收集該患兒的家族史及臨床資料,抽取患兒及其父母外周靜脈血2 mL,對(duì)患兒基因組DNA進(jìn)行新一代測(cè)序分析,并對(duì)疑似致病性突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。結(jié)果該患兒系第三胎第一產(chǎn),前2胎均在圍產(chǎn)期死亡,B超示多囊腎表現(xiàn)。該患兒為男性,4月大,腹部膨隆可觸及質(zhì)硬包塊,腹部超聲提示多囊腎并肝纖維化,新一代測(cè)序顯示患兒PKHD1基因第30外顯子c.3500TC(p.L1167P)雜合突變,遺傳自母親;另外患兒PKHD1基因第58外顯子c.9235_9236del GCins AA(p.A3079K)雜合突變,來自父親;父母表型均正常,這2個(gè)突變均為新發(fā)現(xiàn)的突變。結(jié)論該患兒是由PKHD1基因的復(fù)合雜合突變導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳多囊腎病(ARPKD),結(jié)合家族史推斷,該家系前2胎可能同樣患有ARPKD。新一代測(cè)序可對(duì)該類疾病明確診斷,并有助于遺傳咨詢,以避免該類悲劇的再次發(fā)生。
【圖文】：

?20~30g/L),前白蛋白56.5g/L(參考范圍:125~200g/L),余正常。1.1.3影像學(xué)檢查腹部B超顯示雙腎形態(tài)失常,體積明顯增大,右腎大小約12.3cm×6.2cm,左腎大小約10.5cm×5.6cm,實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng),皮髓質(zhì)分界不清。雙腎實(shí)質(zhì)內(nèi)彌漫分布細(xì)小囊腔,部分囊腔內(nèi)可見小強(qiáng)回聲光點(diǎn),后方伴彗星尾征。肝臟大小可,內(nèi)回聲增強(qiáng)、粗糙,可見細(xì)小網(wǎng)格樣回聲。門靜脈主干內(nèi)徑約0.5cm。肝內(nèi)管道略擴(kuò)張,寬約0.14cm,肝內(nèi)血管略顯迂曲。肝門區(qū)探及一范圍約3.1cm×1.1cm的囊性包塊,壁薄清晰,內(nèi)透聲可。超聲提示:雙腎嬰兒型多囊腎合并肝纖維化;膽總管囊腫(圖1)。患兒出生后23d,曾因黃疸在外院行血液肝功能檢查,示總膽紅素230μmol/L,直接膽紅素17μmol/L。腹部超聲檢查提示:膽囊沉積物;膽總管囊腫;經(jīng)內(nèi)科治療好轉(zhuǎn)后出院。1.2方法1.2.1樣本采集與DNA提取經(jīng)本院倫理委員會(huì)討論通過,與患兒父母簽署知情同意書后,抽取患兒及父母外周靜脈血各2mL,置于EDTA抗凝管中,以天根血液基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取樣本DNA。1.2.2二代測(cè)序首先構(gòu)建基因組文庫,然后通過探針雜交捕獲與多囊腎相關(guān)基因的外顯子及相鄰內(nèi)含子區(qū)域(±50bp),并進(jìn)行富集(由北京信諾佰世醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成)。探針雜交捕獲的具體方法如下:將500ngDNA文庫與PreparationofSureSelectBlockMix緩沖液和設(shè)計(jì)的探針混合,95℃加熱5min,65℃加熱至少5min,加入20μL預(yù)熱至65℃的Cap-tureLibraryHybridizationMix緩沖液,上下吹吸10次,在熱循環(huán)儀上使用熱蓋105℃,每個(gè)雜交反應(yīng)加入30μLMyOneStreptavidinT1magneticbeads磁珠,65℃雜交16~24h。清洗磁珠,向磁珠中加入100μLSureSelectBindingBuffer清洗3次,最后用100μLSureSelectBindingBuffer重懸磁珠。將雜交反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至含有100μL磁珠的試管中,

-660-中華生殖與避孕雜志2017年8月第37卷第8期ChinJReprodContracep,August2017,Vol.37,No.8分析預(yù)測(cè)。2結(jié)果2.1新一代測(cè)序與Sanger測(cè)序驗(yàn)證患兒PKHD1基因存在2個(gè)位點(diǎn)突變,分別是c.3500T>C(p.L1167P)雜合突變和c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)雜合突變(圖2)。Sanger測(cè)序驗(yàn)證顯示,c.3500T>C(p.L1167P)雜合突變來自母親(圖3A,3C),c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)雜合突變來自父親(圖3B,3D),患兒父母為突變攜帶者,這2個(gè)突變均為新發(fā)現(xiàn)的突變。2.2生物信息軟件致病性分析結(jié)果對(duì)c.3500T>C(p.L1167P)和c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)突變進(jìn)行預(yù)測(cè),SIFT和MutationTaster均預(yù)測(cè)為有害突變。采用ExPASY系統(tǒng)中的部分功能,預(yù)測(cè)突變蛋白結(jié)構(gòu)變化顯示,2種突變均使PKHD1基因所編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,這些都可能最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變,詳見因突變位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物,并對(duì)患兒及其父母目標(biāo)序列進(jìn)行Sanger測(cè)序,分析測(cè)序結(jié)果。1.2.4突變位點(diǎn)致病性預(yù)測(cè)分析采用多種生物學(xué)軟件如SIFT、MutationTaster以及ExPASY系統(tǒng),對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行表1二代測(cè)序參數(shù)表測(cè)序深度10×以上20×以上30×以上目標(biāo)基因覆蓋度99.216%98.612%97.570%平均測(cè)序深度170.68×表2Sanger測(cè)序引物序列表PKHD1基因突變引物序列p.L1167Pp.A3079K上游下游上游下游CCAATATGTGGTGCTCTTTGCTGGCTTCTGTGAGGTACTGGATGTGGCAGACTCTTCAGACTGCACATGCCAATACTCAGCAGGTTGGACAGCA:PKHD1基因c.3500T>C(p.L1167P)雜合突變;B:PKHD1基因c.9235_9236delGCinsAA(p.A3079K)雜合突變圖2患兒PKHD1基因新一代測(cè)序截屏圖
【作者單位】： 山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院兒科研究所;山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院腎臟免疫科;
【分類號(hào)】：R726.9

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1 劉淑平;丁潔;王芳;張琰琴;;常染色體隱性遺傳性多囊腎PKHD1基因突變的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十七次全國兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2012年

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本文編號(hào)：2544154