【摘要】：研究背景 支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是極低出生體重早產兒最常見的一種慢性肺疾病。隨著圍產醫(yī)學的不斷進步,包括產前糖皮質激素和出生后肺表面活性物質的應用以及機械通氣的實施,早產兒的存活率不斷升高,BPD的發(fā)病率不斷升高,有很高的長期致殘率和致死率,已經成為NICU最難以解決的問題之一。存活者常有慢性肺功能異常及氣體交換異常等,需要長期依賴氧氣或呼吸機治療,對家庭和社會帶來沉重的經濟和精神負擔,也直接影響患兒日后的生活質量。因此,研究如何防止或延緩BPD的發(fā)生發(fā)展,降低BPD的發(fā)生率是保護我國有限醫(yī)療資源,關乎社會經濟發(fā)展的重要課題。 BPD是一種多因素疾病,其病因及發(fā)病機制極其復雜,涉及高氧、機械通氣、產前感染和產后炎癥反應等多個方面,導致迄今為止尚未有一種有效辦法對其進行預防及治療。目前公認為,氧化應激以及炎癥反應在BPD的發(fā)病學中起了至關重要的作用。氧化應激主要是活性氧(ROS)的產生和抗氧化酶降解ROS的能力失衡導致的[1]。正常情況下,人體內ROS的產生和保護細胞的抗氧化防御系統(tǒng)之間存在著一種微妙的平衡。當ROS增加或抗氧化防御系統(tǒng)功能不足而不足以清除ROS時,這種平衡將會被打破。長時間的高氧暴露將導致過多ROS的生成,當ROS水平超過細胞的抗氧化能力時,細胞將遭受氧化應激損傷。其中,超氧化物歧化酶(SOD)在清除ROS的過程中發(fā)揮了至關重要的作用。其主要的作用是將活性極強的超氧化自由基轉化為過氧化氫和水,然后過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、和谷胱甘肽還原酶將過氧化氫轉變?yōu)樗�。氧化應激損傷的同時可以引起脂質過氧化作用,形成丙二醛(MDA),而SOD能清除氧自由基保護細胞免受損傷,其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。 炎癥反應在BPD的發(fā)生發(fā)展中起了非常關鍵的作用。多種細胞因子包括IL-6、IL-8、IL-10、ICAM-1等均參與了肺炎癥反應,與BPD的發(fā)生密切相關。NF-κB是調控上述多種炎癥因子的重要轉錄因子。其可以上調多種炎癥因子的表達,從而誘發(fā)炎癥的發(fā)生、促進BPD的發(fā)生發(fā)展。NF-κB是P65/P50組成的異源二聚體復合物,通常情況下,與抑制型IκB蛋白結合,存在于細胞的胞漿中,當內皮細胞受損后,NF-κB發(fā)生磷酸化并降解,NF-κB活性增加,p65和p50的mRNA轉錄增加,并發(fā)生核轉位,其中含有轉錄活化區(qū)域的p65與DNA上特定的KB序列結合后可促進多種炎性細胞因子和黏附分子基因的轉錄NF-κB激活后,導致炎癥相關因子的過度表達,引起明顯的炎癥反應。同時,炎癥介質和細胞因子的產生和釋放增多,又進一步激活NF-κB,導致炎癥信號不斷放大,作用時間延長,進一步加重炎癥反應。NF-κB的活化可刺激內皮細胞釋放IL-8,IL-8是強效的中性粒細胞趨化因子,可促進并延長炎癥反應 針對BPD的抗氧化及抗炎藥物也成為國內外研究的主要課題。其中研究最多的藥物是糖皮質激素,其抗炎抗氧化效應顯著,對降低BPD的發(fā)生率有非常重要的作用,然而因其可以引起多種嚴重的不良反應而使其臨床應用受到限制。因此,迫切需要尋找一些新的高效、安全的藥物改善BPD的治療現狀。 我國的天然中藥不僅藥源豐富,且不良反應輕微,有安全低毒、價廉高效等優(yōu)點,具有良好的研究開發(fā)前景。黃芪多糖是目前臨床應用較為廣泛、研究比較深入的中藥之一,其為黃芪中最重要的天然有效成分之一,因其具有抗氧化、清除自由基、抗炎、提高免疫功能等廣泛的生物學活性,近年來越來越受到學者們的重視。其中,黃芪多糖較好的抗氧化及抗炎作用倍受人們的關注。研究發(fā)現,在體外實驗中,APS通過增加細胞的總抗氧化能力以及減少氧自由基的生成進而減輕大鼠肺上皮細胞損傷。APS還可以保護阻塞性黃疸的大鼠腸粘膜免于氧化應激的損傷,其作用機制與增加超氧化物岐化酶SOD以及減少脂質過氧化產物MDA的含量有關。岳曉莉等研究證實APS具有促進慢性潰瘍愈合的作用,其作用機制與降低炎癥細胞表達、降低創(chuàng)面脂質過氧化程度、增強抗氧化酶SOD的表達而發(fā)揮其抗氧化應激損傷的功效有關。另外,APS還可提高紅細胞膜的流動性及超氧化物歧化酶的活性,降低過氧化脂質含量,減輕自由基造成的損傷。研究表明,APS能夠抑制再灌注損傷的人心臟微血管內皮細胞中VCAM-1、ICAM-1及NF-κB mRNA的表達,從而減輕內皮細胞的炎癥反應及黏附作用。在脂多糖誘導的炎癥反應中,APS可以抑制TNF-a和IL-8的產生,可能對阻止炎癥的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮一定的作用。在骨關節(jié)炎中,APS可以減輕滑膜細胞的炎癥反應,并能減少凋亡的產生。然而,關于黃芪多糖在BPD中的研究目前國內外罕見報道。APS是否可以通過抗氧化和(或)抗炎作用防止或延緩BPD的發(fā)生發(fā)生,尚不完全清楚。 人臍靜脈內皮融合肺腺癌細胞(EA.hy926cell)是永生化的臍靜脈內皮細胞系。其結構特點與功能均和肺泡內皮細胞相似,可用于構建肺泡體外模型。EA.hy926細胞已經被廣泛應用于白細胞黏附、內皮細胞的氧化應激、蛋白表達調控等多方面的研究中。 研究目的 1.建立BPD體外細胞模型； 2.探討黃芪多糖通過對EA.hy926細胞抗氧化及抗炎作用有效防治早產兒支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)生發(fā)展； 3.進一步分析黃芪多糖通過NF-KB信號通路發(fā)揮抗炎作用,在分子水平上尋找到黃芪多糖的藥物作用靶點,為臨床上預防及治療BPD開辟新的治療途徑。 研究方法 1.實驗分組EA.hy926細胞呈貼壁生長,培養(yǎng)于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中。實驗分三組,即空氣組,將細胞至于5%CO2.37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、36、48小時；高氧組,將細胞至于三聯混合氣中37℃培養(yǎng)24、36、48小時；高氧+APS組,將細胞至于三聯混合氣中37℃培養(yǎng)24、36、48小時。 2.運用化學試劑方法分別檢測各組中SOD、MDA、ROS的表達水平。 3.運用熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(real-time PCR)技術和免疫印跡(Western Blotting)法分別檢測各組中ICAM-1、IL-8、NF-kB p65mRNA和蛋白的動態(tài)表達水平。 4.采用SPSS13.0軟件進行分析。數據采用X±S表示,各組間均數比較采用析因分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果 1、在24、36兩個時間點高氧組SOD水平均低于APS組和空氣組,空氣組與APS組比較則沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)；在48小時時間點高氧組與APS組相比沒有統(tǒng)計學意義(P0.05),而空氣組SOD水平則明顯高于高氧組和APS組。36小時APS組SOD水平明顯高于24小時APS組SOD水平(F=28.845,P0.01)。 2、在24、36兩個時間點高氧組MDA水平均明顯高于APS組和空氣組,空氣組與APS組比較則沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)；在48小時時間點高氧組與空氣組、APS組相比沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3、在24、36兩個時間點高氧組ROS水平均明顯高于APS組和空氣組,APS組ROS水平明顯低于空氣組(P0.01)；在48小時時間點高氧組與APS組相比沒有統(tǒng)計學意義(P0.05),而空氣組ROS水平則明顯低于高氧組和APS組。48小時APS組ROS水平明顯高于24、36小時APS組ROS水平(F=675.247,P0.01)。 4、在24、36、48小時三個時間點高氧組的IL-8基因表達水平均明顯高于APS組,24、36小時高氧組的IL-8基因表達水平為APS組的3倍,48小時高氧組的IL-8基因表達水平為APS組的2倍。三個時間點之間各組IL-8基因表達水平無明顯差異(F=0.233,P=0.794)。 5、在24、36、48小時三個時間點高氧組的ICAM-1基因表達水平均明顯高于APS組,在24小時時間點高氧組的ICAM-1基因表達水平為APS組的4倍,在36小時時間點高氧組的ICAM-1基因表達水平為APS組的1.58倍,在48小時時間點高氧組的ICAM-1基因表達水平為APS組的1.63倍,。三個時間點之間各組ICAM-1基因表達水平無明顯差異(F=1.947,P=0.159)。 6、高氧組各時間點的NF-KB、ICAM-1、IL-8蛋白表達均高于空氣組。APS組各時間點NF-KB及ICAM-1、IL-8蛋白表達均明顯低于高氧組。 結論 1.APS可增加EA.hy926細胞內的SOD表達,同時能降低細胞MDA水平,從而清除細胞內氧化應激產生的ROS,達到抗氧化目的,保護細胞免受氧化應激損傷。 2.APS可顯著減低EA.hy926細胞內ROS的含量,提高抗氧化應激能力。 3.APS可下調NF-κBp65、ICAM-1、IL-8的表達,減輕炎癥反應,協同抗氧化作用保護細胞。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R722.6

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