【摘要】：[研究背景]病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是兒童最常見的后天性心臟病之一,急性期可以因心源性休克、急性心力衰竭或嚴(yán)重心律失常而導(dǎo)致患兒死亡,遷延發(fā)作可以導(dǎo)致左心室功能障礙或擴(kuò)張型心肌病。病毒性心肌炎是由于病毒感染和/或病毒感染后介導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致的心臟炎性病變。多種病毒感染均可導(dǎo)致疾病發(fā)生,其中最常見的為柯薩奇病毒B組3型(Coxsackievirus B3, CVB3)。CVB3是小核糖核酸病毒科家族中的一種微小、無包膜、正鏈RNA腸道病毒,對(duì)心肌細(xì)胞有高度親和力,其導(dǎo)致病毒性心肌炎的病因機(jī)制主要包括：病毒的直接損傷、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、炎性因子的參與、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、抗心肌自身抗體作用以及導(dǎo)致心肌膠原重構(gòu)等,其中細(xì)胞凋亡在CVB3所致的病毒性心肌炎的發(fā)病過程當(dāng)中占有至關(guān)重要的地位。因此,凋亡機(jī)制的研究,也為病毒性心肌炎防治的研究開辟了一條新的途徑。調(diào)控或參與凋亡的信號(hào)途徑眾多,到底哪些途徑主導(dǎo)了CVB3所致的病毒性心肌炎細(xì)胞的凋亡,他們又是怎樣起作用的,目前尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),磷脂肌醇3-激酶-蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)通路在CVB3所致的病毒性心肌炎中發(fā)揮重要作用,并且該通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵途徑之 課題組前期工作業(yè)已證實(shí)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與了心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控,但其具體分子機(jī)制尚未完全闡明。 [目的]該課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上,以HeLa細(xì)胞為模型,通過對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)系統(tǒng)中不同調(diào)控節(jié)點(diǎn)的干預(yù),探討CVB3通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制,旨在為CVB3導(dǎo)致病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制,尤其是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制方面提供更為詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 [方法]利用HeLa細(xì)胞作為擴(kuò)增CVB3病毒的載體,擴(kuò)增收獲的病毒進(jìn)行滴度測(cè)定后,將HeLa細(xì)胞作為研究CVB3病毒感染細(xì)胞的有效模型,同時(shí)探討P13K的抑制劑LY294002和mTOR的抑制劑雷帕霉素(Rapamycin),加入病毒感染HeLa細(xì)胞的時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)體系中,通過流式細(xì)胞術(shù)等,研究以LY294002抑制P13K后和Rapamycin抑制mTOR之后,CVB3感染HeLa細(xì)胞所引起的細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象的改變。利用免疫細(xì)胞化學(xué)、Real time PCR和Western Blot等方法,研究相關(guān)信號(hào)通路上關(guān)鍵分子的表達(dá)變化情況。 [結(jié)果] (1)CVB3感染對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響：在HeLa細(xì)胞中擴(kuò)增CVB3并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定后,選取100TCID50(按Reed-Muench法測(cè)定通過病毒的50%組織細(xì)胞感染指數(shù)TCID50=10-5)病毒感染HeLa細(xì)胞。接種病毒后的HeLa細(xì)胞爬片組從6h開始出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE),病毒接種48h后,細(xì)胞病理形態(tài)改變更為顯著,病變細(xì)胞數(shù)目顯著增多,至72h病變細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞數(shù)的40%左右。對(duì)照組HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)表現(xiàn)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無顯著變化。采用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CVB3感染組與對(duì)照組HeLa細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果顯示自病毒感染后12h起,HeLa細(xì)胞的凋亡率已顯著高于對(duì)照組,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),被感染細(xì)胞凋亡率逐漸升高,至48h達(dá)高峰,其后則趨于穩(wěn)定。CVB3感染后,HeLa細(xì)胞中Akt與mTOR蛋白表達(dá)量下降。 (2)LY294002抑制P13K對(duì)CVB3感染的HeLa細(xì)胞及下游分子表達(dá)和磷酸化的影響：10μM及以上的LY294002對(duì)HeLa細(xì)胞P13K表達(dá)有顯著抑制作用。用濃度為10μM的LY294002處理CVB3感染的HeLa細(xì)胞,HeLa細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變較單純CVB3感染的HeLa細(xì)胞更為顯著,其凋亡率顯著升高,表明LY294002可能導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的增加。CVB3感染HeLa細(xì)胞后,Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平及Akt、p-Akt與mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸下調(diào)趨勢(shì)；而經(jīng)LY294002處理的CVB3感染HeLa細(xì)胞,隨著LY294002作用時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞中Akt與mTOR mRNA表達(dá)水平較單純CVB3感染呈現(xiàn)更為顯著的下調(diào),Akt、p-Akt與mTOR、 p-mTOR蛋白表達(dá)水平亦呈相應(yīng)下調(diào),且下調(diào)水平較單純CVB3感染更為顯著。 (3)雷帕霉素(Rapamycin)抑制mTOR對(duì)CVB3感染的HeLa細(xì)胞及下游分子表達(dá)和磷酸化的影響：10nM及以上的Rapamycin對(duì)HeLa細(xì)胞mTOR表達(dá)有顯著抑制作用。用濃度為10nM的Rapamycin處理CVB3感染的HeLa細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變的比率及凋亡率均較單純CVB3感染的HeLa細(xì)胞顯著升高,提示Rapamycin亦可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加。CVB3感染HeLa細(xì)胞后mTOR的下游分子4EBP1與P70S6K mRNA水平表達(dá)下調(diào),4EBP1、p-4EBP1與P70S6K、p-P70S6K蛋白水平表達(dá)下調(diào),而經(jīng)Rapamycin干預(yù)后上述分子的表達(dá)水平進(jìn)一步下調(diào),較未感染組及單純CVB3感染組均有顯著性差異。 [結(jié)論] (1)CVB3感染可導(dǎo)致HeLa細(xì)胞凋亡增加,呈劑量與時(shí)間依賴性。 (2)CVB3感染可抑制HeLa細(xì)胞中的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 (3)PI3K抑制劑LY294002可阻斷PI3K/Akt/mTOR信號(hào)從而促進(jìn)CVB3感染的HeLa細(xì)胞凋亡。 (4) mTOR抑制劑Rapamycin通過阻斷mTOR/4EBP1及mTOR/P70S6K通路促進(jìn)CVB3感染的HeLa細(xì)胞凋亡。 (5)在PI3K/Akt/mTOR信號(hào)系統(tǒng)中,抑制PI3K或mTOR任何一環(huán)均可促進(jìn)CVB3感染的HeLa細(xì)胞凋亡,并且這種促凋亡效應(yīng)可能是通過下游分子4EBP1與P70S6K的磷酸化實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

部分細(xì)胞漂浮。病毒接種48h后，細(xì)胞上述病理形態(tài)改變更為顯著，病變細(xì)胞數(shù)目顯著增多（圖3-1-1、表3-1-2)。而對(duì)照組HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)表現(xiàn)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無顯著變化，15

博士學(xué)位論文 3結(jié)果3.1.4 CVB3感染后HeLa細(xì)胞Akt與mTOR的表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CVB3感染后不同時(shí)間點(diǎn)HeLa細(xì)胞中Akt與mTOR蛋白的定位與表達(dá)情況。染色結(jié)果顯示，Akt與mTOR在HeLa細(xì)胞中分布于胞菜中，，小部分位于細(xì)胞核，免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈黃褐色細(xì)顆粒狀。CVB3感染后，Akt與mTOR在HeLa細(xì)胞中的染色變淺，表明其蛋白表達(dá)量下調(diào)；隨感染時(shí)間延長(zhǎng)，Akt與mTOR蛋白表達(dá)量有逐漸下降趨勢(shì)，24h后至48h其表達(dá)量無顯著性差異（見圖3-1-3)。A
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R725.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2538708