【摘要】：第一部分高IgE綜合征的臨床特征、STAT3基因和Th17細(xì)胞分析 目的：探討高IgE綜合征患兒臨床特征，分析STAT3基因和外周血Th17細(xì)胞數(shù)量。 方法：總結(jié)9例NIH評(píng)分≥40分、臨床診斷高IgE綜合征患兒的臨床特征，用RT-PCR及DNA-PCR直接測(cè)序法，分析患兒及家系成員STAT3基因，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)7例患兒外周血PBMC CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果：9例患兒均有濕疹、反復(fù)肺炎、異常增高的血清IgE水平和嗜酸性粒細(xì)胞增高，NIH評(píng)分范圍為45~77分。5例患兒為STAT3基因熱點(diǎn)突變V637M或R382W/Q，2例患兒為位于SH2結(jié)構(gòu)域的新型錯(cuò)義突變T620S和R609G，另2例患兒未發(fā)現(xiàn)STAT3基因突變。與正常對(duì)照相比（0.40%-2.25%），6例STAT3突變的患兒外周血CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例明顯下降或缺乏（0%~0.28%）（P0.05）；而1例無STAT3突變的患兒Th17細(xì)胞數(shù)量在正常范圍內(nèi)，為0.53%。 結(jié)論：9例無親緣關(guān)系的高IgE綜合征患兒中，7例有STAT3基因雜合錯(cuò)義突變，包括2種新型突變。并非所有NIH評(píng)分高于40分HIES患者都有STAT3基因突變，Th17減少者發(fā)生STAT3基因突變可能性大，更可能是AD-HIES。 第二部分STAT3基因新型突變T620S質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定 目的：構(gòu)建STAT3基因新型突變T620S真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞，為研究STAT3蛋白及其突變蛋白功能打下基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)Genbank中人STAT3mRNA序列（NM_139276.2）設(shè)計(jì)含特定位點(diǎn)突變T620S的PCR引物，兩端分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。以野生型STAT3表達(dá)載體（pAcGFP1-N1-STAT3-WT）DNA為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，將目的基因亞克隆至T載體中，重組T載體經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定正確后，雙酶切重組T載體和真核載體pAcGFP1-N1，回收目的片段，經(jīng)T4連接酶連接、轉(zhuǎn)化后，構(gòu)建真核表達(dá)載體pAcGFP1-N1-STAT3-T620S，進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)度，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果：酶切、測(cè)序均表明pAcGFP1-N1-STAT3-T620S突變質(zhì)粒構(gòu)建成功，且在COS7細(xì)胞中觀察到綠色熒光表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率是47.02%。 結(jié)論：成功構(gòu)建了STAT3新型突變T620S真核表達(dá)載體，并能在COS7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，為研究STAT3蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。 第三部分STAT3基因熱點(diǎn)區(qū)域突變對(duì)STAT3蛋白功能的影響 目的：探討AD-HIES相關(guān)STAT3熱點(diǎn)突變及新型（T620S）突變體分子活化、運(yùn)動(dòng)軌跡變化，及其在AD-HIES發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：將人STAT3野生型真核表達(dá)質(zhì)粒WT-STAT3-GFP，突變質(zhì)粒R382W-STAT3-GFP，V637M-STAT3-GFP和T620S-STAT3-GFP用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染至無內(nèi)源性STAT3表達(dá)的COS7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒均設(shè)轉(zhuǎn)染劑對(duì)照組、空載體對(duì)照組、有刺激和無刺激組。轉(zhuǎn)染36小時(shí)后用EGF刺激（100ng/ml）20min，提取胞漿和胞核蛋白，Western blot檢測(cè)胞漿和胞核中各組間STAT3與磷酸化STAT3(pSTAT3)表達(dá)量，比較其差異；轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加入EGF（100ng/ml）刺激，即用激光共聚焦顯微鏡在1小時(shí)內(nèi)連續(xù)觀察STAT3的聚集及核轉(zhuǎn)位，比較各組間差異，同時(shí)在刺激后1小時(shí)用DAPI染細(xì)胞核進(jìn)行核定位，觀察STAT3分子在核內(nèi)的聚集情況。 結(jié)果：從Western blot圖中觀察到，EGF刺激前后在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的COS7細(xì)胞胞漿和胞核中野生型和三種突變質(zhì)粒（R382W-STAT3-GFP，V637M-STAT3-GFP和T620S-STAT3-GFP）均有120KD的STAT3-GFP融合蛋白表達(dá)，但T620S表達(dá)較弱，且出現(xiàn)120KD、92KD兩個(gè)條帶。EGF刺激COS7細(xì)胞后，胞漿和胞核中pSTAT3在轉(zhuǎn)染野生型和R382W均有較強(qiáng)表達(dá)，V637M表達(dá)較弱，而T620S突變幾乎無pSTAT3表達(dá)。從激光共聚焦顯微鏡觀察到，在EGF刺激后，WT-STAT3-GFP迅速形成聚集體并核轉(zhuǎn)位，1小時(shí)內(nèi)可在核內(nèi)看到明顯的聚集現(xiàn)象；其核輸出及降解過程大約從2.5小時(shí)開始，至7小時(shí)時(shí)基本結(jié)束。R382W-STAT3-GFP形成聚集體和核轉(zhuǎn)位的時(shí)間均晚于野生型，量也較少；而其核輸出過程在4小時(shí)內(nèi)結(jié)束。V637M-STAT3-GFP僅在胞漿內(nèi)看到少量STAT3聚集體形成，1小時(shí)時(shí)在核膜周圍有少量聚集，核轉(zhuǎn)位不明顯。T620S-STAT3-GFP在1小時(shí)內(nèi)幾乎無STAT3聚集。激光共聚焦顯微鏡與Western blot的pSTAT3結(jié)果基本一致。 結(jié)論：有STAT3磷酸化的R382W突變可見核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，STAT3磷酸化弱的V637M突變核轉(zhuǎn)位少，缺乏STAT3磷酸化的T620S突變無核轉(zhuǎn)位。STAT3SH2結(jié)構(gòu)域的V637M和T620S突變較DNA結(jié)合域的R382W突變對(duì)STAT3磷酸化、聚集體形成及核轉(zhuǎn)位過程影響更為顯著。同為SH2D結(jié)構(gòu)域的突變，T620S對(duì)STAT3蛋白功能的影響較V637M更顯著。深入研究STAT3不同結(jié)構(gòu)域、不同突變對(duì)STAT3蛋白功能的影響可進(jìn)一步闡釋AD-HIES發(fā)病機(jī)制，從而為AD-HIES的治療提供新途徑。
【圖文】：

突變患兒的父母沒有相同的突變。例 4 和例 5 STAT3 全（因例 5 無 cDNA 標(biāo)本，僅分析了 STAT3 DNA 23 個(gè)外A 例 1：c.1859 C>G, T620S B 例 7：c.1825 A>G, R609GC 例 2：c.1909 G>A, V637M D 例 6：c.1909 G>A, V637M

圖 2-1 pAcGFP1-N1 載體質(zhì)粒圖譜Figure 2-1 Plasmids profile of pAcGFP1-N1 vector1.2.2 從濾紙上獲得質(zhì)粒將點(diǎn)有pAcGFP1-N1載體和人STAT3野生型質(zhì)粒hSTAT3-WT的濾紙各剪成4份放入 1.5mlEP 管中，各取 1 份放入另一 EP 管（余放入-80℃冰箱保存），加入 1×TE50μl，用吸頭將濾紙搗碎使其溶解，放入 4℃冰箱過夜。1.2.3 氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞（1）從-80℃低溫冰箱中取出大腸桿菌 DH5α，待其融化后用接種環(huán)蘸取于平板劃線接種后放入 37℃孵箱培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。（2）從平板中挑取直徑為 2-3mm 的單菌落，接種于 3-5mlLB 液體培養(yǎng)基中，于 37℃210 轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng) 12 小時(shí)；
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R725.9

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 舒嵐;高IgE綜合征的臨床特征和分子診斷[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：2532622