【摘要】：Dnm3os是由位于1號染色體上,嵌合在Dynamin 3基因內(nèi)含子中一個獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位所編碼的長非編碼RNA(long noncoding RNA,or lncRNA)。包括出自本實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的以往數(shù)據(jù)顯示,Dnm3os所攜帶的兩個微型RNA之一,miR-214,可以與原癌基因N-Ras形成一個調(diào)控環(huán)路,通過加速細(xì)胞從分裂期逃逸,從而促進(jìn)成肌母細(xì)胞沿肌纖維方向或在BMP的作用下沿骨方向定向分化。我博士論文研究發(fā)現(xiàn)miR-214雖然在胚胎發(fā)育中不具必要的作用,但是卻可以促進(jìn)成年肌肉的損傷修復(fù),在胚胎成纖維細(xì)胞中也具有抑制細(xì)胞增殖的作用。我還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-214調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的作用還體現(xiàn)在抑制兒童中常見的軟組織惡性腫瘤,橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcma,RMS)發(fā)生方面。這種腫瘤主要是由肌肉前體細(xì)胞的惡性增殖與低分化所造成的,因此與miR-214的作用原理有密切關(guān)系。我發(fā)現(xiàn)miR-214在人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系中明顯低表達(dá),在人胚胎型橫紋肌肉瘤細(xì)胞系(RD)中過表達(dá)miR-214可以顯著抑制其增殖,退出細(xì)胞周期而開始肌分化。裸鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了miR-214抑制RD細(xì)胞在體移植成瘤的能力。通過對N-ras 3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3’-UTR)中miR-214結(jié)合位點(diǎn)的突變分析,我再一次證實(shí)了miR-214和N-ras調(diào)節(jié)環(huán)路在細(xì)胞生長與RMS發(fā)生中的重要作用。。Noonan綜合征是一種常見的常染色體顯性遺傳疾病,患者具有特定的面部表征,通常身材矮小,先天性心臟缺陷,以及認(rèn)知障礙等臨床癥狀。由于導(dǎo)致Noonan綜合征的已知遺傳因素都撁集在RAS/MAPK信號通路,因而這一綜合癥也稱為RAS病(RASopathies)。通過與美國明尼蘇達(dá)州兒童醫(yī)院合作,我們發(fā)現(xiàn)了一位由母系遺傳而來的Noonan綜合征病童。沒有發(fā)現(xiàn)RAS/MAPK通路基因突變,但是比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)顯示1號染色體1q24.3區(qū)域內(nèi)一個690kb狹小片段缺失,涵蓋DYNAMIN3,嵌其中的LncRNA-Dnm3os,以及PIGC,clorf105,clorf9以及FSALG 4個基因。利用qPCR,我發(fā)現(xiàn)該家系受影響的成員外周血中NS特征性基因的表達(dá)明顯上升;過表達(dá)Dnm3os可以抑制NS特征性基因的表達(dá)。雖然生物信息學(xué)分析6個Noonan綜合癥致病基因是miR-214的靶基因,但是miR-214敲除小鼠并沒有出現(xiàn)相應(yīng)癥狀,提示Dnm3os全片段的缺失與Noonan綜合癥發(fā)生密切相關(guān)。結(jié)合已經(jīng)發(fā)表的LncRNA-Dnm3os敲除小鼠表型數(shù)據(jù),我們推測LncRNA-Dnm3os在骨骼軟骨內(nèi)鈣化發(fā)育過程中起關(guān)鍵性作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在軟骨內(nèi)鈣化成骨過程中LncRNA-Dnm3os促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖抑制其分化,維持增殖性軟骨細(xì)胞的自我更新,為軟骨細(xì)胞分化提供足夠的細(xì)胞來源,而且這功能的發(fā)揮不依賴于鑲嵌其中的miR-199a_2和mi R-214。以上結(jié)果表明,LncRNA-Dnm3os在骨骼軟骨內(nèi)鈣化發(fā)育過程中起關(guān)鍵性作用,從而使患者表現(xiàn)出典型的綜合癥。以上發(fā)現(xiàn)為臨床診斷治療提供新的理論依據(jù)。
[Abstract]:Dnm3os is a long non-coding RNA (long noncoding RNA,or lncRNA). Encoded by an independent transcriptional unit located on chromosome 1 and chimeric in the intron of Dynamin 3 gene. Previous data, including from our laboratory, show that miR-214, one of the two miniature RNA carried by Dnm3os, can form a regulatory loop with proto-oncogene N-Ras by accelerating the escape of cells from mitotic phase. In order to promote the differentiation of myoblasts along the direction of muscle fiber or in the direction of bone under the action of BMP. My doctoral study found that miR-214 does not play a necessary role in embryonic development, but it can promote the repair of adult muscle injury and inhibit cell proliferation in embryonic fibroblasts. I further found that the role of miR-214 in regulating cell growth is also reflected in the inhibition of rhabdomyosarcoma (rhabdomyosarcma,RMS), a common soft tissue malignant tumor in children. This tumor is mainly caused by malignant proliferation and poor differentiation of muscle progenitor cells, so it is closely related to the principle of miR-214. I found that the expression of miR-214 in human rhabdomyosarcoma cell line was significantly low. Overexpression of miR-214 in human embryonic rhabdomyosarcoma cell line (RD) could significantly inhibit its proliferation, withdraw from the cell cycle and begin muscle differentiation. Tumor-bearing experiments in nude mice also confirmed the ability of miR-214 to inhibit the tumorigenesis of RD cells in vivo. The mutation of miR-214 binding site in N-ras 3 'terminal non-transcriptional region (3'-UTR) was analyzed. I have once again confirmed the important role of miR-214 and N-ras regulatory loops in cell growth and RMS. Noonan syndrome is a common autosomal dominant genetic disease with specific facial representation and usually short stature. Congenital heart defects, as well as cognitive impairment and other clinical symptoms. Because the known genetic factors leading to Noonan syndrome are concentrated in the RAS/MAPK signaling pathway, the syndrome is also known as RAS disease (RASopathies). In partnership with Minnesota Children's Hospital, we found a maternal child with Noonan syndrome. No RAS/MAPK pathway gene mutation was found, but the comparative genomic hybrid (comparative genomic hybridization,CGH) showed the deletion of a narrow 690kb fragment in the 1q24.3 region of chromosome 1, covering LncRNA-Dnm3os, and PIGC,clorf105, embedded in DYNAMIN3,. Clorf9 and FSALG four genes. By using qPCR, I found that the expression of NS characteristic gene in peripheral blood of affected members of the family was significantly increased, and overexpression of Dnm3os could inhibit the expression of NS characteristic gene. Although bioinformatics analysis of six genes causing Noonan syndrome is the target gene of miR-214, there are no corresponding symptoms in miR-214 knockout mice, suggesting that the deletion of the whole fragment of Dnm3os is closely related to the occurrence of Noonan syndrome. Based on the published phenotypic data of LncRNA-Dnm3os knockout mice, we speculate that LncRNA-Dnm3os plays a key role in the development of calcification in skeletal cartilage. It was further found that LncRNA-Dnm3os promoted the proliferation and inhibition of the differentiation of cartilage cells, maintained the self-renewal of proliferating cartilage cells, and provided sufficient cell source for the differentiation of cartilage cells in the process of intra-cartilage calcification and osteogenesis. Moreover, the function of this function does not depend on the mosaic of miR-199a_2 and miR- 214. These results suggest that LncRNA-Dnm3os plays a key role in the development of calcification in skeletal cartilage, which makes the patients show typical syndrome. The above findings provide a new theoretical basis for clinical diagnosis and treatment.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R725.9

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本文編號：2477985