【摘要】：背景與目的 β-蛋白生成障礙性血發(fā)病機(jī)制及治療現(xiàn)狀 β-珠蛋白生成障礙性貧血(β-thalassemia)是世界上最常見的常染色體隱形遺傳病之一,其發(fā)病機(jī)制是β珠蛋白基因的突變或缺失,導(dǎo)致p珠蛋白鏈合成減少(β+)或完全不能合成(β0),相對過剩的α肽鏈形成包涵體沉積于細(xì)胞膜上,引起紅細(xì)胞膜的氧化損傷、變形能力下降和攜氧能力的改變,使紅細(xì)胞壽命縮短、在脾臟內(nèi)被大量破壞而引起溶血性貧血。目前β-珠蛋白生成障礙性貧血的確切治愈方法只有造血干細(xì)胞移植,但是價格高昂、配型成功率低等問題限制了其廣泛應(yīng)用。胎兒血紅蛋白(etal hemoglobin, HbF)合成的增加可以代償缺失的p珠蛋白鏈的功能,與相對過剩的a鏈構(gòu)成胎兒血紅蛋白,降低α鏈與非α鏈之間的不平衡,減輕a鏈包涵體所致的原位溶血。因此,可以重新激活紅系細(xì)胞中已近乎關(guān)閉的γ珠蛋白基因的誘導(dǎo)藥物成為目前的研究熱點(diǎn)之一。 γ珠蛋白基因誘導(dǎo)藥物及其作用機(jī)制 1982年國外首次報告應(yīng)用5-氮雜胞苷(5-azacytidine,5-AZAC)治療β-珠蛋白生成障礙性貧血患者取得較好療效之后,國內(nèi)外對γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑進(jìn)行了大量研究,目前已知的Y珠蛋白基因誘導(dǎo)劑大致可分為：①DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,如5-AZAC和地西他濱(decitabine)等；②組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制劑,如曲古霉素A (trichostatin A, TSA)和apicidin等；③短鏈脂肪酸及其衍生物,如丁酸鹽類及其衍生物和丙戊酸等；④細(xì)胞毒性藥物,如羥基脲(hydroxyurea, HU)等；⑤免疫調(diào)節(jié)藥物,如thalidomide和pomalidomide等；⑥激素類藥物,如黃體酮等；⑦細(xì)胞因子,如促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)等；⑧天然來源的藥物：如呋喃香豆素(Furocoumarins)、雷帕霉素(Rapamycin)、白藜蘆醇(Resveratrol)和我們課題組發(fā)現(xiàn)的黃芪多糖等。一些藥物如HU和EPO等已用于臨床并在緩解貧血癥狀方面取得了一定的療效,但是這些藥物也存在著許多不足,如有效劑量接近中毒劑量、遠(yuǎn)期療效和安全性仍有待觀察、部分病人對于治療沒有反應(yīng)、半衰期短和價格昂貴等,在臨床應(yīng)用上受到很大限制。因此,探索Y珠蛋白基因誘導(dǎo)劑的作用機(jī)制,進(jìn)而開發(fā)更為安全有效、適于臨床應(yīng)用治療p-珠蛋白生成障礙性貧血的新藥是目前的研究重點(diǎn)。 Y珠蛋白基因誘導(dǎo)劑的作用機(jī)制十分復(fù)雜,國內(nèi)外對其進(jìn)行了大量研究,研究者們早期認(rèn)為Y珠蛋白基因誘導(dǎo)劑可以通過抑制DNA合成(如HU)或者改變紅系細(xì)胞動力學(xué)加速紅系細(xì)胞分化(如白藜蘆醇)等重新激活γ珠蛋白基因。近十年來細(xì)胞信號通路、表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄因子在γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑中的作用被諸多報道所證實。來自羊、靈長類和人類的實驗結(jié)果提示在成人γ珠蛋白基因藥物誘導(dǎo)中發(fā)揮作用的信號通路包括絲裂原活化蛋白激酶(mito gen-activated protein kinases, MAPKs)信號通路、可溶性鳥苷環(huán)化酶(Soluble guanylyl cyclase,sGC)和cGMP信號通路、PKG信號通路等。隨后,研究者們發(fā)現(xiàn)γ珠蛋白基因誘導(dǎo)劑可以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu),促進(jìn)γ珠蛋白基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,從而上調(diào)γ珠蛋白基因基因表達(dá),例如抑制]3DAC活性(如TSA)和促使γ珠蛋白基因啟動子區(qū)低甲基化(如5-AZAC)等。 p38MAPK信號通路在藥物誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)中的重要作用 從1998年發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號通路可以被造血因子激活并參與了EPO誘導(dǎo)的紅系分化和血紅蛋白合成之后,p38MAPK信號通路在γ珠蛋白基因表達(dá)中的重要作用也逐漸受到重視。研究顯示p38MAPK信號通路參與了丁酸鹽和丙戊酸誘導(dǎo)的HbF合成,并在HDAC抑制劑TSA、MS-275和scrptaid等誘導(dǎo)γ珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄的過程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期的研究結(jié)果也證明p38MAPK信號通路不僅參與了丁酸鈉(sodium butyrate, NaB)和黃芪多糖誘導(dǎo)的K562細(xì)胞γ珠蛋白基因表達(dá),而且p38持續(xù)磷酸化可以上調(diào)γ珠蛋白基因mRNA并增加HbF合成。上述結(jié)果提示p38MAPK信號通路激活可能是藥物誘導(dǎo)Y珠蛋白表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。 表觀遺傳修飾在p38MAPK信號通路誘導(dǎo)丫珠蛋白基因表達(dá)中的重要作用 本課題組前期通過染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)等方法,證明p38MAPK信號通路激活可提高γ珠蛋白基因啟動子區(qū)組蛋白H3、H4乙酰化水平和組蛋白H3磷酸化水平,且該作用可被p38MAPK特異性抑制劑SB203580阻斷,提示p38MAPK信號通路可通過介導(dǎo)γ珠蛋白基因啟動子區(qū)表觀遺傳修飾調(diào)控Y珠蛋白基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子在p38MAPK信號通路誘導(dǎo)丫珠蛋白基因表達(dá)中的重要作用 本課題組通過建立p38高/低磷酸化的K562細(xì)胞模型,利用凝膠遷移或電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMS A)和super-EMSA實驗對γ珠蛋白基因表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)GATA結(jié)合蛋白1(GATA binding protein-1, GATA1)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element binding protein, CREB)和激活轉(zhuǎn)錄因子-2(ictivating transcription factor2, ATF-2)可與Gγ珠蛋白啟動子區(qū)特異DNA序列結(jié)合,提示這三種轉(zhuǎn)錄因子可能參與了p38MAPK信號通路對γ珠蛋白基因的表達(dá)調(diào)控。Pace等已經(jīng)證明HDAC抑制劑可以通過激活活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)誘導(dǎo)p38磷酸化,并由此激活下游的轉(zhuǎn)錄激活蛋白如CREB和ATF-2調(diào)控γ珠蛋白基因表達(dá)；但是作為紅系特異轉(zhuǎn)錄因子的GATAl在p38MAPK信號通路調(diào)控Y珠蛋白基因表達(dá)中的作用尚未明確。GATA1對丫珠蛋白基因表達(dá)的作用 GATA1是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,其穩(wěn)固結(jié)合位點(diǎn)廣泛分布于珠蛋白基因和其他紅系特異基因的啟動子和增強(qiáng)子,可轉(zhuǎn)錄激活所有已知的紅系特異基因,因此,被認(rèn)為是紅系造血的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。GATA1高活性是珠蛋白基因表達(dá)和紅細(xì)胞成熟必不可少的條件,培養(yǎng)人臍血CD36+細(xì)胞至第7天,GATA1mRNA比第四天上調(diào),而p和γ珠蛋白mRNA在第7天和15天均比第4天上調(diào),表明GATA1的表達(dá)峰在珠蛋白基因mRNA表達(dá)峰之前。另外,本課題組前期發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號通路激活的同時GATA1磷酸化水平增加,且該現(xiàn)象可被p38特異抑制劑SB203580阻斷,提示GATA1可能參與了p38MAPK信號通路對γ珠蛋白基因的表達(dá)調(diào)控,但是其明確作用及機(jī)制仍有待進(jìn)一步驗證和探討。 因此,本研究首先建立了不同p38MAPK和GATA1狀態(tài)的細(xì)胞模型,采用realtime RT-PCR和Western blotting方法分析GATA1在p38MAPK信號通路誘導(dǎo)Y珠蛋白基因表達(dá)過程中的變化和沉默GATA1基因?qū)38MAPK信號通路誘導(dǎo)丫珠蛋白基因表達(dá)的影響,從而驗證GATA1在p38MAPK信號通路誘導(dǎo)丫珠蛋白基因表達(dá)中的作用；然后通過ChIP技術(shù)探討GATA1對p38MAPK信號通路介導(dǎo)的表觀遺傳修飾調(diào)控γ珠蛋白基因表達(dá)的影響。研究結(jié)果不僅可以闡明GATA1在經(jīng)p38MAPK信號通路介導(dǎo)的表觀遺傳修飾調(diào)控γ珠蛋白基因表達(dá)中的作用,為揭示藥物誘導(dǎo)丫珠蛋白基因作用機(jī)制提供新的科學(xué)證據(jù),而且可以為開發(fā)和設(shè)計治療p-珠蛋白生成障礙性貧血的新藥提供新的靶點(diǎn)。方法： 1.細(xì)胞株 本研究以人紅白血病K562細(xì)胞為研究對象,設(shè)不表達(dá)GATA1基因和γ珠蛋白基因的人宮頸癌Hela細(xì)胞為對照。 2.細(xì)胞模型： 2.1p38高/低磷酸化K562細(xì)胞模型的建立、分組和命名：①穩(wěn)定p38高磷酸化的K562細(xì)胞[K562-MKK3(Glu)細(xì)胞]；②穩(wěn)定p38低磷酸化的K562細(xì)胞[K562-MKK3(Ala)細(xì)胞]；③載體對照(K562-pcDNA3.1細(xì)胞)④p38MAPK信號通路特異抑制劑SB203580預(yù)處理的K562-MKK3(Glu)細(xì)胞[K562-MKK3(Glu)+SB細(xì)胞1⑤0.5mM NaB處理48h的K562細(xì)胞[K562(NaB)細(xì)胞]；⑥SB203580預(yù)處理1h后再用0.5mM NaB處理48h的K562細(xì)胞[K562(NaB)+SB細(xì)胞]；⑦設(shè)立K562細(xì)胞對照；⑧設(shè)立Hela細(xì)胞對照。 2.2沉默GATAl基因的K562細(xì)胞模型的建立、分組和命名：根據(jù)shRNA設(shè)計原則設(shè)計1對64nt寡核苷酸,送公司合成并退火。采用分子克隆方法構(gòu)建pSUPER-shRNA真核表達(dá)重組質(zhì)粒并進(jìn)行酶切和測序鑒定,以脂質(zhì)體介導(dǎo)將pSUPER-shRNA重組質(zhì)粒和pSUPER-EGFP空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的K562細(xì)胞,經(jīng)G418篩選和鑒定后,建立①轉(zhuǎn)染pSUPER-shRNA重組質(zhì)粒的K562細(xì)胞(K562-shRNA細(xì)胞)；②轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP空質(zhì)粒的K562細(xì)胞(K562-pSUPER細(xì)胞)；③轉(zhuǎn)染pSUPER-shRNA重組質(zhì)粒的K562(NaB)細(xì)胞[K562(NaB)-shRNA細(xì)胞]；④轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP空質(zhì)粒的K562(NaB)細(xì)胞[K562(NaB)-pSUPER細(xì)胞]；⑤設(shè)立K562細(xì)胞對照；⑥設(shè)立K562(NaB)細(xì)胞對照。 3. Real time RT-PCR和Western blotting:采用real time RT-PCR方法檢測Aγ、Gγ珠蛋白基因和GATA1基因mRNA水平;采用Western blotting方法檢測p38磷酸化(p-p38)、GATA1、GATA1磷酸化(p-GATA1)和HbF水平。 4.染色質(zhì)免疫共沉淀：采用基于real time PCR分析的ChIP技術(shù)分析Aγ和Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)GATA1結(jié)合水平(Aγ-GATA1和Gγ-GATA1)、組蛋白H3乙酰化(acetylated H3, acH3)水平(Aγ-acH3和Gγ-acH3)和組蛋白H3磷酸化水平(Aγ-ph/acH3和Gγ-ph/ac H3。) 5.統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。兩樣本比較采用配對樣本t檢驗,多個樣本均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way AN OVA)。根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果,如方差齊時多重比較采用LSD (Least-significant-Difference)方法檢驗；如方差不齊時方差分析采用近似F檢驗Welch法,多重比較采用Dunnett'sT3方法檢驗。檢驗水準(zhǔn)為a=0.05。結(jié)果1.GATAl在p38MAPK信號通路誘導(dǎo)丫珠蛋白基因表達(dá)中的變化 1.1高/低磷酸化p38MAPKK562細(xì)胞p38磷酸化水平的變化 與K562-pcDNA3.1細(xì)胞和K562細(xì)胞相比,K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞p-p38水平分別升高了2.189倍和2.159倍(P≤0.026)；SB預(yù)處理之后,K562-MKK3(Glu)+SB細(xì)胞和K562(NaB)+SB細(xì)胞p-p38水平下降,分別為K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞的37.764%和56.461%(P≤0.030)；K562-MKK3(Ala)細(xì)胞p-p38水平下降,為K562-pcDNA3.1細(xì)胞的42.235%(P0.001)。K562-pcDNA3.1細(xì)胞與K562細(xì)胞p-p38水平之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.997)。Hela細(xì)胞p-p38水平約為K562細(xì)胞的55.591%(P=0.083)。 1.2高/低磷酸化P38MAPKK562細(xì)胞GATA1mRNA水平 與K562-pcDNA3.1細(xì)胞和K562細(xì)胞相比,K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞GATA1mRNA水平分別增加1.565倍和1.533倍(P0.002); SB預(yù)處理之后,K562-MKK3(Glu)+SB細(xì)胞和K562(NaB)+SB細(xì)胞GATA1mRNA水平下降,分別為K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞的73.114%和50.209%(P0.009); K562-MKK3(AIa)細(xì)胞、K562-pcDNA3.1細(xì)胞和K562細(xì)胞GATA1mRNA水平之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.111)。Hela細(xì)胞中未檢測到GATA1mRNA表達(dá)。1.3高/低磷酸化p38MAPKK562細(xì)胞GATAl表達(dá)及其磷酸化 與K562細(xì)胞相比,K562(NaB)細(xì)胞GATA1表達(dá)升高了1.532倍(P0.001)；K562細(xì)胞、K562-pcDNA3.1細(xì)胞、K562-MKK3(Glu)細(xì)胞、K562-MKK3(Ala)細(xì)胞、K562(NaB)+SB細(xì)胞和K562-MKK3(Glu)+SB細(xì)胞GATA1表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.055)。Hela細(xì)胞中未檢測到GATAl表達(dá)。 與K562-pcDNA3.1細(xì)胞和K562細(xì)胞相比,K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞p-GATA1水平分別增加了2.066倍和1.532倍(P0.001)；K562-MKK3(Glu)+SB細(xì)胞和K562(NaB)+SB細(xì)胞p-GATA1水平下降,分別為K562-MKK3(G1u)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞的30.996%和38.802%(P0.001)。K562-MKK3(Ala)細(xì)胞p-GATA1水平下降,為K562-pcDNA3.1細(xì)胞的46.632%(P0.001)。K562-pcDNA3.1細(xì)胞與K562細(xì)胞p-GATAl水平之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.077)。Hela細(xì)胞中未檢測到p-GATAl表達(dá)。 1.4高/低磷酸化p38MAPKK562細(xì)胞Aγ和Gγ珠蛋白mRNA水平 與K562-pcDNA3.1細(xì)胞和K562細(xì)胞相比,K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞Aγ-mRNA水平分別增加1.399倍和1.777倍(P≤0.010)；SB預(yù)處理之后,K562-MKK3(Glu)+SB細(xì)胞和K562(NaB)+SB細(xì)胞Aγ-mRNA水平下降,分別為K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞的30.648%和49.599%(P≤0.010)；K562-MKK3(Ala)細(xì)胞Aγ-mRNA水平下降,為K562-pcDNA3.1細(xì)胞的38.925%(P=0.006)；K562-pcDNA3.1細(xì)胞與K562細(xì)胞Aγ-mRNA0水平之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.999)。He1a細(xì)胞中未檢鋇到Aγ-mRNA表達(dá)。 與K562-pcDNA3.1細(xì)胞和K562細(xì)胞相比,K562-MKK3(G1u)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞Gγ-mRNA水平分別增加了1.770倍和2.088倍(P0.001)；SB預(yù)處理之后,K562-MKK3(Glu)+SB細(xì)胞和K562(NaB)+SB細(xì)胞Gγ-mRNA水平降低,分別為K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞的23.638%和77.756%(P0.001)；K562-MKK3(Ala)細(xì)胞Gγ-mRNA水平下降,為K562-pcDNA3.1細(xì)胞的37.996%(P0.001)；K562.pcDNA3.1細(xì)胞與K562細(xì)胞Gγ-mRNA水平之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.596)。Hela細(xì)胞中未檢測到Gγ-mRNA表達(dá)。1.5高/低磷酸化p38MAPKK562細(xì)胞HbF表達(dá) 與K562-pcDNA3.1細(xì)胞和K562細(xì)胞相比,K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞HbF表達(dá)分別增加了1.841倍和1.786倍(P0.001)；SB預(yù)處理之后,K562-MKK3(Glu)+SB細(xì)胞和K562(NaB)+SB細(xì)胞HbF表達(dá)下降,分別為K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞的51.515%和35.142%(P0.001)；K562-MKK3(Ala)細(xì)胞HbF表達(dá)下降,為K562-pcDNA3.1細(xì)胞的45.144%(P0.001)；K562-pcDNA3.1細(xì)胞與K562細(xì)胞HbF表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.613).Hela細(xì)胞中未檢測到HbF表達(dá)。 上述結(jié)果提示p38MAPK信號通路激活可誘導(dǎo)γ珠蛋白基因達(dá),且GATA1mRNA和磷酸化水平的變化與p38磷酸化水平有關(guān)。2.沉默GATAl基因?qū)aB誘導(dǎo)的p38MAPK信號通路誘導(dǎo)丫珠蛋白基因表達(dá)的影響 2.1沉默GATA1基因?qū)aB誘導(dǎo)的p38高磷酸化細(xì)胞GATA1mRNA的影響 K562-shRNA細(xì)胞和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞GATA1mRNA表達(dá)下降,分別為K562-pSUPER細(xì)胞和K562(NaB)-pSUPER細(xì)胞的47.904%和48.644%(P≤0.023)。 2.2沉默GATAl基因?qū)aB誘導(dǎo)的p38高磷酸化細(xì)胞GATAl表達(dá)及其磷酸化的影響 K562-shRNA細(xì)胞和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞GATA1表達(dá)減少,分別為K562-pSUPER和K562(NaB)-pSUPER細(xì)胞的58.810%和32.522%(P0.001)。 K562-shRNA細(xì)胞和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞中p-GATAl水平下降,分別為K562-pSUPER細(xì)胞和K562(NaB)-pSUPER細(xì)胞的59.792%和49.023%(P0.023)。 2.3沉默GATAl基因降低NaB誘導(dǎo)的p38高磷酸化K562細(xì)胞Aγ和Gγ珠蛋白mRNA水平 K562-shRNA細(xì)胞Aγ-mRNA水平為K562-pSUPER細(xì)胞的1.137倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)但無實際意義；K562(NaB)-shRNA細(xì)胞Aγ-mRNA水平下降,為K562(NaB)-pSUPER細(xì)胞的50.599%(P0.001)。 K562-shRNA細(xì)胞和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞Gy-mRNA水平下降,分別為K562-pSUPER細(xì)胞和K562(NaB)-pSUPER細(xì)胞的62.726%和36.035%(P0.001)。 2.4沉默GATAl基因減少NaB誘導(dǎo)的p38高磷酸化K562細(xì)胞中HbF合成 K562-shRNA和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞HbF表達(dá)下降,分別為K562-pSUPER和K562(NaB)-pSUPER細(xì)胞的63.019%和80.332%(P≤0.001)。 上述結(jié)果說明沉默GATA1基因可下調(diào)NaB誘導(dǎo)的p38高磷酸化細(xì)胞GATA1mRNA水平、GATA1表達(dá)和磷酸化水平、γ珠蛋白mRNA水平和HbF合成,進(jìn)一步提示GATA1在p38MAPK信號通路誘導(dǎo)的γ珠蛋白基因表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。 3GATAl在p38MAPK信號通路介導(dǎo)表觀遺傳修飾調(diào)控γ珠蛋白基因表達(dá)中的作用 3.1γ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的的%Input值 3.1.1Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)GATA1的%Input值 與陰性對照IgG抗體相比,抗GATA1抗體ChIP后,K562(NaB)細(xì)胞Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值增高(t=7.282,P=0.018),K562細(xì)胞(t=2.567, P=0.124)、K562(NaB)+SB細(xì)胞(t=3.445,t=0.075)和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞(t=4.193,P=0.052)抗GATA1抗體與陰性對照IgG抗體ChIP沉淀下來的Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,Hela細(xì)胞Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值低于陰性對照IgG(t=15.741,P=0.004)。 3.1.2Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)GATAl的%Input值 與陰性對照IgG相比,抗GATA1抗體ChIP后K562細(xì)胞(t=17.312,P=0.003)和K562(NaB)細(xì)胞(t=7.895, P=0.016)Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值升高,K562(NaB)細(xì)胞Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值升高幅度最大,達(dá)到陰性對照IgG的2.828倍；K562(NaB)+SB細(xì)胞(t=0.068,P=0.952)和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞(t=2.067,P=0.175)Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值與陰性對照IgG相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Hela細(xì)胞Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值低于陰性對照IgG(t=21.840,P=0.002)。 3.1.3Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)acH3的%Input值 與陰性對照IgG抗體相比,抗acH3抗體ChIP后K562細(xì)胞(t=15.412,P=0.004)和K562(NaB)細(xì)胞(t=9.295,P=0.011)Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值升高,K562(NaB)細(xì)胞Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值升高幅度達(dá)到陰性對照IgG抗體的7.372倍;K562(NaB)+SB細(xì)胞Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值降低(t=12.401,t=0.006); K562(NaB)-shRNA細(xì)胞抗acH3抗體和陰性對照IgG抗體ChIP后沉淀下來的Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.749,P=0.532)；Hela細(xì)胞抗acH3抗體沉淀后Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值低于陰性對照IgG(t=6.092,P=0.026)。 3.1.4Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)acH3的%Input值 與陰性對照IgG抗體相比,抗acH3抗體ChIP后,K562細(xì)胞(t=8.474,P=0.014)和K562(NaB)細(xì)胞(t=10.320,P=0.009)Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值升高,K562(NaB)細(xì)胞Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值升高幅度達(dá)到陰性對照IgG的9.614倍；K562(NaB)+SB細(xì)胞(t=3.277,P=0.082)和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞(t=0.478,P=0.680)抗acH3抗體和陰性對照IgG抗體ChIP后沉淀下來的Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Hela細(xì)胞Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值低于陰性對照IgG抗體(t=31.261,P=0.001)。 3.1.5Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)ph/acH3的Input%值 與陰性對照IgG抗體相比,抗ph/acH3抗體ChIP后K562細(xì)胞(t=6.755,P=0.021)、K562(NaB)細(xì)胞(t=22.589, P=0.002)、K562(NaB)+SB細(xì)胞(t=4.778,P=0.041)和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞(t=10.333,P=0.009)Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值升高；Hela細(xì)胞抗ph/acH3抗體和陰性對照IgG抗體ChIP后沉淀下來的Aγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.090,P=0.172)。 3.1.6Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)ph/acH3的Input%值 與陰性對照IgG抗體相比,抗ph/acH3抗體ChIP后,K562細(xì)胞(t=10.130,P=0.010)、K562(NaB)細(xì)胞(t=23.144, P=0.002)和K562(NaB)-shRNA細(xì)胞(t=15.524, P=0.004) Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值升高,K562(NaB)細(xì)胞Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值升高幅度達(dá)到陰性對照IgG的49.092倍；K562(NaB)+SB細(xì)胞抗ph/acH3抗體和陰性對照IgG抗體ChIP后沉淀下來的Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.263,P=0.051)。Hela細(xì)胞Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)擴(kuò)增片段的%Input值低于陰性對照IgG抗體(t=6.465,P=0.023)。 3.2NaB激活p38MAPK信號通路誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)過程中丫珠蛋白基因啟動子區(qū)GATAl相對水平和表觀遺傳修飾的變化 3.2.1NaB激活p38MAPK信號通路增加K562細(xì)胞Aγ和Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)GATAl相對水平 與K562細(xì)胞相比,K562(NaB)細(xì)胞Ay-GATA1和Gy-GATA1水平升高,分別為K562細(xì)胞的1.740倍和1.721倍(P≤0.004)；SB預(yù)處理之后,K562(NaB)+SB細(xì)胞的Aγ-GATA1和Gγ-GATA1水平下降,分別為K562(NaB)細(xì)胞的26.064%和33.823%(P≤0.001)。3.2.2NaB激活p38MAPK信號通路增加K562細(xì)胞Aγ和Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)組蛋白H3乙�；� 與K562細(xì)胞相比,K562(NaB)細(xì)胞Ay-acH3和Gy-acH3水平升高,分別為K562細(xì)胞的3.049倍和4.960倍(P≤0.017)；SB預(yù)處理之后,K562(NaB)+SB細(xì)胞Ay-acH3和Gy-acH3水平下降,分別為K562(NaB)細(xì)胞的2.248%和0.584%(P≤0.011)。 3.2.3NaB激活p38ME APK信號通路增加K562細(xì)胞Aγ和Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)組蛋白H3磷酸化水平 與K562細(xì)胞相比,K562(NaB)細(xì)胞Ay-ph/acH3和Gy-ph/acH3水平升高,分別為K562細(xì)胞的8.639倍和19.456倍(P≤0.004)；SB預(yù)處理之后,K562(NaB)+SB細(xì)胞Aγ-ph/acH3和Gγph/acH3水平下降,分別為K562(NaB)細(xì)胞的12.324%和6.433%(P≤0.004)。 3.3沉默GATAl基因?qū)aB激活p38MAPK信號通路介導(dǎo)表觀遺傳修飾的影響 3.3.1沉默GATAl基因?qū)aB誘導(dǎo)的p38高磷酸化K562細(xì)胞Aγ和Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)GATAl相對水平的影響 K562(NaB)-shRNA細(xì)胞Aγ-GATA1和Gγ-GATA1水平下降,分別為K562(NaB)細(xì)胞的17.846%和18.457%(P0.001)。 3.3.2沉默GATAl基因?qū)aB誘導(dǎo)的p38高磷酸化K562細(xì)胞Aγ和Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)acH3相對水平的影響 K562(NaB)-shRNA細(xì)胞Aγ-acH3和Gγ-acH3水平下降,分別為K562(NaB)細(xì)胞的14.845%和11.213%(P0.008)。3.3.3沉默GATAl基因?qū)aB誘導(dǎo)的p38高磷酸化K562細(xì)胞Aγ和Gγ珠蛋白基因啟動子區(qū)ph/acH3相對水平的影響 K562(NaB)-shRNA細(xì)胞Aγ-ph/acH3和Aγ-ph/acH3水平下降,分別為K562(NaB)細(xì)胞的18.100%和9.584%(P≤0.003) 上述結(jié)果提示GATA1在p38MAPK信號通路介導(dǎo)的表觀遺傳修飾調(diào)控γ珠蛋白基因表達(dá)過程中起重要作用。 結(jié)論 1.研究證明在p38高磷酸化的K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞中,GATA1mRNA上調(diào),GATA1磷酸化增強(qiáng),γ珠蛋白基因mRNA上調(diào),HbF合成增加,K562(NaB)細(xì)胞GATA1表達(dá)增加；在p38低磷酸化的K562-MKK3(Ala)細(xì)胞中,GATA1磷酸化減弱,Y珠蛋白基因mRNA下調(diào),HbF合成減少；與K562-MKK3(Glu)細(xì)胞和K562(NaB)細(xì)胞相比,K562-MKK3(Glu)+SB細(xì)胞和K562(NaB)+SB細(xì)胞GATA1mRNA下調(diào),GATA1磷酸化減弱,γ珠蛋白基因mRNA下調(diào),HbF合成減少。進(jìn)一步證明GATA1表達(dá)的變化與p38磷酸化水平有關(guān)。 2.首次實驗證明沉默GATA1基因可使NaB誘導(dǎo)的p38高磷酸化細(xì)胞GATA1mRNA和丫珠蛋白mRNA下調(diào),GATA1表達(dá)減少和磷酸化減弱,HbF合成減少,提示GATAl在p38MAPK信號通路誘導(dǎo)的Y珠蛋白基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。 3.首次實驗證明沉默GATA1基因之后,NaB激活p38MAPK信號通路誘導(dǎo)Y珠蛋白基因表達(dá)時,Y珠蛋白基因啟動子區(qū)GATA1結(jié)合水平下降,組蛋白H3乙�；瘻p弱,組蛋白H3磷酸化減弱,Y珠蛋白基因表達(dá)下降,HbF合成減少。提示GATAl在p38MAPK信號通路介導(dǎo)表觀遺傳修飾調(diào)控丫珠蛋白基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R725.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2476269