發(fā)布時間：2019-04-27 18:22

【摘要】：維生素A (vitamin A, VA)是兒童時期最重要的微量營養(yǎng)素之一,能保護皮膚和粘膜的完整性,調(diào)節(jié)機體的免疫功能。目前,VA缺乏仍然是影響我國兒童健康的重要因素之一,可導(dǎo)致兒童病毒感染性疾病的發(fā)病率和死亡率增高。本研究團隊的前期研究已經(jīng)證實：VA能維持免疫細(xì)胞的正常發(fā)育和功能活動,促進(jìn)抗體的產(chǎn)生,從而提高機體的抗感染免疫力。但對于VA在抗病毒免疫方面的研究還有待深入。近年來,在我國部分地區(qū)出現(xiàn)了手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的爆發(fā)流行,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢,主要病原體為腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)。目前尚無針對EV71的疫苗或特異性治療藥物,主要依靠機體的抗病毒免疫力清除病毒,因此研究影響抗病毒免疫力的因素對于防治HFMD具有重要的臨床意義。HFMD多發(fā)生于5歲以下嬰幼兒,與VA缺乏處于相似的好發(fā)年齡段。另一方面,HFMD的典型病理損傷出現(xiàn)在皮膚和粘膜,而VA具有維護皮膚粘膜完整性的作用。因此,我們推測VA營養(yǎng)可能與兒童HFMD之間存在相互影響。鑒于以上原因,本研究將兒童HFMD作為切入點,通過臨床調(diào)查和體外細(xì)胞培養(yǎng),探討VA對兒童抗病毒免疫力的影響及其分子機制,進(jìn)一步證實VA營養(yǎng)在維護兒童免疫功能中的重要作用。 第一部分維生素A營養(yǎng)對手足口病患兒抗病毒免疫力的影響 目的通過分析HFMD患兒VA營養(yǎng)狀態(tài)與血清干擾素-α(interferon-α, IFN-α)及EV71-IgM抗體水平的相關(guān)性,探討VA營養(yǎng)對兒童抗病毒免疫力的影響。 方法選取2010年10月至2011年6月我院傳染科收治的450例手足口病患兒為研究對象,診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病診療指南(2010年版)》；同時選取與患兒年齡和性別一致的113例非感染兒童作為對照組。1.采用熒光定量PCR法檢測糞便樣本中腸道病毒EV71；2.采用高效液相色譜法測定血清VA水平；3.采用24小時飲食回顧法調(diào)查膳食VA攝入水平,并結(jié)合臨床病情進(jìn)行分析；4. ELISA法測定血清IFN-α及EV71-IgM抗體水平。 結(jié)果 1.450例患兒中,男性303例(67.3%),女性147例(32.7%),平均年齡2.5歲,其中226例(50.2%)糞便EV71檢測呈陽性,170例(37.8%)發(fā)生不同程度的并發(fā)癥。 2.總體血清VA水平為0.73±0.26μmol/L;其中237例(52.7%)血清VA濃度低于正常水平(0.7μmol/L).EV71陽性的患兒血清VA濃度(0.64±0.24μmol/L)低于EV71陰性患兒(O.825±0.25μmol/L),P0.01.發(fā)生并發(fā)癥的患兒血清VA濃度(0.66±0.23μmol/L)低于未發(fā)生并發(fā)癥的患兒(0.78±0.27μmol/L),P0.01. 3.92%的患兒每日膳食VA攝入量低于推薦攝入量,其中1,-4歲年齡組患兒膳食VA攝入不足情況最嚴(yán)重(297.1±126.1μg視黃醇當(dāng)量/天),僅為推薦攝入量的59.4%。 4.與非感染對照組相比,患兒的血清IFN-α濃度顯著升高,且VA正常組患兒血清FN-α,濃度(112.28(78.38～155.5)pg/mL)顯著高于VA缺乏組患兒(57.29(39.92～85.4)pg/mL),P0.01.發(fā)生并發(fā)癥組患兒的血清IFN-α (67.13(46.57～109)pg/mL)濃度低于未發(fā)生并發(fā)癥組(87.7(52.28～130.65)pg/mL),P0.01.值得注意的是：相關(guān)分析結(jié)果顯示：HFMD患兒血清VA水平與IFN-α濃度呈正性相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.58,P0.01)。 5.VA正常組患兒血清EV71-IgM抗體濃度(32.9±11.8ng/mL)顯著高于VA缺乏組(28.1±9.4ng/m),P0.01.HFMD患兒血清VA水平與EV71-IgM抗體濃度呈正性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.41,P0.01)。 6.VA缺乏組的患兒并發(fā)癥的發(fā)生率(45.99%)顯著高于VA正常組(28.64%),P0.01。 結(jié)論 1.HFMD患兒普遍存在膳食VA攝入不足； 2.HFMD患兒中VA缺乏癥的發(fā)生率增高,血清VA總體水平降低； 3.伴有VA缺乏癥的HFMD患兒中,血清IFN-α和EV71-IgM的濃度降低,且與血清VA水平的降低呈正性相關(guān)關(guān)系； 4.在VA缺乏的MD患兒中并發(fā)癥的發(fā)生率增高； 5.VA營養(yǎng)不足可能導(dǎo)致了兒童抗HFMD的免疫力降低。 第二部分視黃酸抑制EV71病毒感染的體外研究 目的通過體外細(xì)胞培養(yǎng),證實VA的體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物—全反式視黃酸(all-trans-retinoic acid,atRA)抗EV71病毒感染的作用及其途徑。 方法體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞,分為8組：1.對照組：無atRA干預(yù),無EV71感染；2.atRA組：給予atRA干預(yù)；3.Ro組：加入視黃酸受體β(retinoic acid receptor-α,RAR-α)特異性拮抗劑(Ro41-5253,Ro);4.atRA+Ro組：同時加入atRA和Ro;5.EV71組：給予EV71感染；6.EV71+atRA組：EV71感染細(xì)胞后加入atRA;7. EV71+Ro組：EV71感染細(xì)胞后加入Ro;8. EV71+atRA+Ro組：EV71感染細(xì)胞后同時加入atRA和Ro進(jìn)行干預(yù)。分別于干預(yù)后24、48小時進(jìn)行以下檢測：1.免疫熒光染色法檢測EV71抗原的表達(dá)；2.流式細(xì)胞計數(shù)法檢測EV71感染細(xì)胞的百分率；3.流式細(xì)胞計數(shù)法檢測EV71誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率；4. ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-a水平；4.熒光定量PCR法檢測RAR-a, IFNA1和IFN受體IFNAR1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 1.EV71可感染體外培養(yǎng)的人單核細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。干預(yù)后48小時,與EV71組(45.22±3.68%)相比,EV71+atRA組細(xì)胞EV71感染率(26.52±4.33%)顯著降低,P0.01。此外,干預(yù)后24小時,EV71+atRA組細(xì)胞凋亡率(11.31±1.73%)也低于EV71組(17.64±1.12%),P0.01； 2.EV71感染后24小時,atRA干預(yù)可上調(diào)IFNA1與IFNAR1mRNA表達(dá)；且這種作用在EV71與atRA共同作用時更加顯著。感染后48小時,atRA干預(yù)使IFN-α的蛋白水平顯著升高。 3.干預(yù)后24小時,atRA上調(diào)RAR-α mRNA的表達(dá)。與atRA單獨作用相比,EV71+atRA組RAR-α mRNA的表達(dá)更高；而單獨的EV71感染對RAR-α mRNA的表達(dá)無明顯影響。 4.當(dāng)Ro同時加入時,atRA的上述作用均被阻抑。 結(jié)論 1. atRA能降低EV71對體外培養(yǎng)U937細(xì)胞的感染率,減少EV71感染造成的細(xì)胞凋亡,具有體外抑制EV71病毒的作用； 2. atRA可上調(diào)EV71感染細(xì)胞IFN-a mRNA和蛋白的表達(dá)； 3. atRA體外抑制EV71病毒的作用主要是通過RAR-a介導(dǎo)的。 第三部分視黃酸對EV71誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答RIG-I通路的調(diào)節(jié)作用 目的研究atRA對抗EV71病毒免疫應(yīng)答視黃酸誘導(dǎo)基因-I(retinoic acid induced gene-I, RIG-I)通路的影響,探討atRA發(fā)揮抗病毒作用的分子機制,為更深入的臨床研究提供理論和實驗依據(jù)。 方法分離EV71感染患兒與非感染對照兒童的外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)。體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞,給予EV71和/或atRA干預(yù)。分別抽提這兩種細(xì)胞的RNA,采用PCR array的方法,檢測與抗病毒免疫相關(guān)的84個主要基因的表達(dá)。 結(jié)果通過對EV71感染的HFMD患兒PBMC的檢測,我們發(fā)現(xiàn),與非感染對照組相比,EV71感染組有50個基因的表達(dá)變化超過了2倍,其中27個基因表達(dá)上調(diào),23個表達(dá)下調(diào)。EV71感染可下調(diào)RIG-I抗病毒通路中病毒識別受體RIG-I,接頭蛋白IPS-1,效應(yīng)基因TRAF3、RAF6,下游信號傳導(dǎo)及靶基因TBK1、IRF3、IFNA1、IFNARl的表達(dá)；而體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的檢測結(jié)果顯示：對EV71感染的U937細(xì)胞進(jìn)行atRA干預(yù),可上調(diào)這些基因的表達(dá)。 結(jié)論EV71感染可影響抗病毒免疫應(yīng)答RIG-I通路,而atRA對EV71體外細(xì)胞感染所誘導(dǎo)的RIG-I信號通路的變化具有調(diào)節(jié)作用,可能是其抗EV71病毒感染作用的分子機制。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R725.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2467210