【摘要】：第一部分甲基丙二酰輔酶A變位酶基因新錯義突變功能研究目的:對8種甲基丙二酰輔酶A變位酶(methylmalonyl-Co A mutase,MCM)基因(MUT)的變異進行MCM蛋白表達量和酶活性的分析,驗證這8種突變的致病性。方法:(1)選取8例甲基丙二酸血癥患者的8種未報道的MUT基因錯義突變(L140P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D),利用生物信息學軟件預測這些突變對MCM蛋白結構和功能的影響;(2)構建攜帶野生型及這8種突變型MUT c DNA的表達載體并轉染293T細胞;(3)Western blot檢測野生型及突變型MCM蛋白在293T細胞中的表達量;(4)UPLC檢測293T細胞中野生型及突變型MCM酶活性。結果:(1)成功構建了含MUT c DNA的野生型和8種突變型(L140P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D)表達載體;(2)Real time PCR結果顯示8種錯義突變型質粒轉染后293T細胞MUT基因m RNA水平與野生型比較無顯著差異(P0.05);(3)western blot結果提示5種錯義變異(L140P、A141T、G161V、W309G及Q514K)較野生型MCM蛋白表達量顯著下降(P0.05),而I505T、I597R及G723D與野生型相比較無差異(P0.05);(4)UPLC結果提示8種錯義突變型質粒轉染后293T細胞的MCM蛋白酶活性(0.31±0.21、1.66±0.01、0.76±0.04、0.19±0.13、1.37±0.24、0.46±0.09、0.86±0.27和1.37±0.13nmol/min/mg protein)均較野生型(3.11±0.13 nmol/min/mg protein)減低(P均0.05);(5)結合患者臨床表型分析,證實這8種MUT基因錯義突變均為致病突變。.結論:MUT基因的8種錯義突變(L140P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D)均未影響m RNA表達水平,其中5種突變導致MCM蛋白表達量降低,8種突變均導致MCM酶活性下降,均被證實為致病突變。第二部分小鼠腦神經(jīng)元經(jīng)MMA誘導后凋亡變化及Lnc RNA表達與凋亡信號通路中相關m RNA關系分析目的:通過表達譜芯片對甲基丙二酸(methylmalonic acid,MMA)誘導的原代小鼠皮層神經(jīng)元進行檢測,篩選與神經(jīng)元凋亡相關的差異表達長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,Lnc RNA)及m RNA,分析Lnc RNA與凋亡信號通路中相關m RNA的關系,探討MMA腦損傷的部分機制。方法:(1)利用不同濃度的甲基丙二酸誘導小鼠原代皮層神經(jīng)元6h、12h及24h,觀察神經(jīng)元凋亡情況;(2)通過表達譜芯片檢測甲基丙二酸誘導下差異表達的Lnc RNA及m RNA;(3)對差異表達基因進行基因功能富集(GO)分析及Pathway分析,分析與凋亡相關的Lnc RNA及m RNA;(4)分析Lnc RNA參與甲基丙二酸誘導的神經(jīng)元凋亡可能途徑。(5)分析Lnc RNA與凋亡信號通路中相關m RNA的關系.結果:(1)小鼠神經(jīng)元經(jīng)甲基丙二酸誘導后,呈現(xiàn)濃度及時間依賴性凋亡現(xiàn)象;(2)表達譜芯片篩選出與甲基丙二酸作用呈表達遞增趨勢的Lnc RNA 113條,m RNA248條;表達呈遞減趨勢的Lnc RNA 61條,m RNA191條,這些基因主要與轉錄調控及細胞增殖與凋亡等功能相關;(3)Pathway分析結果顯示22條m RNA包含在MAPK信號通路;8條m RNA包含在P53信號通路;(4)包含在MAPK信號通路中的Atf4,、Dusp8、Hspa2等7條m RNA的表達與Lnc RNA呈顯著相關;(5)6條Lnc RNA(NONMMUT041857,Know TID_00005724,NONMMUT001282、NONMMUT044301、NONMMUT006249、NONMMUT062897)與Atf4表達顯著相關;(6)Lnc RNA可能通過調控Atf4的表達激活了MAPK信號通路中的一系列凋亡相關基因(p-JNK、c-Jun及p-Akt等)的表達,導致神經(jīng)元的凋亡。結論:(1)本研究進一步證實了MMA腦損傷機制之一為腦神經(jīng)元凋亡;(2)MMA誘導的腦神經(jīng)元凋亡途徑可能通過MAPK及P53信號通路;(3)Lnc RNA可能通過調控Atf4差異表達,進而調控MAPK信號通路,參與MMA誘導的神經(jīng)元凋亡,為進一步研究MMA腦損傷機制提供理論基礎。
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【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R725.9
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本文編號：2464096