【摘要】：目的:1.建立性早熟伴胰島素抵抗雌鼠模型,測定雌二醇水平及其脂肪組織中芳香化酶表達(dá)、mRNA轉(zhuǎn)錄水平,應(yīng)用二甲雙胍進(jìn)行藥物干預(yù)后測定雌激素水平及脂肪組織芳香化酶表達(dá)變化,并與對照組進(jìn)行比較。探討二甲雙胍在改善糖代謝、脂代謝及胰島素抵抗的同時(shí),對雌激素水平及脂肪組織芳香化酶表達(dá)的影響,為臨床應(yīng)用二甲雙胍治療胰島素抵抗的同時(shí)改善女童性早熟提供更多理論依據(jù)。2.應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立3T3-L1胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型,以不同濃度二甲雙胍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù),并以丙酸睪酮作為催化反應(yīng)底物,觀察脂肪細(xì)胞在胰島素抵抗情況下芳香化酶表達(dá)及其活性,同時(shí)觀察二甲雙胍干預(yù)對芳香化酶表達(dá)的影響是否與MEK/ERK信號通路有關(guān),并進(jìn)一步討論其干預(yù)的分子水平機(jī)制。方法:1.正常斷乳(21天)SD雌性幼鼠45只,隨機(jī)分為普通飲食組(NC組10只)和高脂飲食組(FC組35只),每日觀察雌鼠陰門開啟情況并記錄陰門開啟日齡。對比NC組陰門開啟日齡,將FC組分為陰門早開組即性早熟組(FC-P組),對其進(jìn)行稱重、取血測雌二醇及空腹胰島素水平,行OGTT并測定各時(shí)間點(diǎn)血糖,結(jié)果顯示存在胰島素抵抗,證明性早熟伴胰島素抵抗雌鼠造模成功,并將其隨機(jī)分為模型組(IR組)、低劑量治療組(IR-L組)和高劑量治療組(IR-H組)。治療組分別給予不同劑量二甲雙胍(Metformin,Met)灌胃治療6周。測量給藥前后大鼠的體重,并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取血檢測各組大鼠的空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、雌二醇(E2)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL),計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島抵抗指數(shù)(HOMA-IR);處死各組大鼠并取腎周及卵巢周圍脂肪進(jìn)行稱重,計(jì)算脂體比;應(yīng)用蛋白免疫印跡法(western blot)及實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)檢測脂肪組織中芳香化酶的表達(dá)及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平。2.應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對3T3-L1前脂肪細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化。參考相關(guān)文獻(xiàn)對前脂肪細(xì)胞的分化方法,對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化:將培養(yǎng)狀態(tài)良好的3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿,加入含地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(ibmx)的培養(yǎng)液進(jìn)行逐步誘導(dǎo)分化,至第9天90%以上的細(xì)胞呈成熟脂肪細(xì)胞表型,可用于后續(xù)試驗(yàn)。細(xì)胞內(nèi)可見明顯脂滴,采用油紅o染色法進(jìn)行成熟脂肪細(xì)胞鑒定。胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立:對已經(jīng)誘導(dǎo)分化成熟的3t3-l1脂肪細(xì)胞進(jìn)行分組處理,采用高糖/高胰島素處理脂肪細(xì)胞,測定培養(yǎng)液上清中葡萄糖含量并計(jì)算其消耗量,以葡萄糖消耗量及消耗率反映脂肪細(xì)胞胰島素抵抗程度。在成功建立胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,觀察細(xì)胞中芳香化酶表達(dá)、基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,以及不同濃度二甲雙胍對其影響:設(shè)空白對照組、胰島素抵抗模型組、不同濃度二甲雙胍干預(yù)組(10-5、10-4、10-3mol/l)。藥物處理48h后應(yīng)用westernblot及rt-pcr方法檢測各組脂肪細(xì)胞中芳香化酶的表達(dá)及其mrna轉(zhuǎn)錄水平;同時(shí)應(yīng)用酶聯(lián)免疫方法,以丙酸睪酮為底物,測定各組培養(yǎng)液中雌二醇濃度,以了解各組細(xì)胞中芳香化酶催化活性。在胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型+10-3mol/l二甲雙胍組中加入mek抑制劑(pd98059),觀察加入pd98059后芳香化酶表達(dá)、mrna轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果:1.高脂飼料喂養(yǎng)的雌鼠可出現(xiàn)性早熟、肥胖,表現(xiàn)為陰門開啟時(shí)間提前、體重及體內(nèi)雌激素水平升高(p0.05);并同時(shí)伴有胰島素抵抗。二甲雙胍可降低胰島素抵抗雌鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量及脂體比(p0.05)。二甲雙胍在調(diào)節(jié)糖、脂代謝的同時(shí)改善胰島素抵抗、降低雌鼠體內(nèi)雌激素水平(p0.05);且二甲雙胍呈劑量依賴性下調(diào)糖代謝指標(biāo)及雌激素水平。性早熟伴胰島素抵抗雌鼠脂肪組織芳香化酶表達(dá)及基因轉(zhuǎn)錄水平均較正常飲食雌鼠升高,二甲雙胍呈劑量依賴性下調(diào)性早熟伴胰島素抵抗雌鼠脂肪組織芳香化酶表達(dá)及其基因轉(zhuǎn)錄水平(p0.05)。2.采用高糖/高胰島素培養(yǎng)方法,可將誘導(dǎo)分化成熟的3t3-l1脂肪細(xì)胞建立為胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型。胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中芳香化酶表達(dá)量升高,二甲雙胍呈劑量依賴性下調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中芳香化酶的表達(dá)及雌激素的產(chǎn)生(p0.05)。加入mek抑制劑后,二甲雙胍下調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞芳香化酶的作用減弱。結(jié)論:1.高脂飼料喂養(yǎng)的雌鼠可出現(xiàn)性早熟、肥胖及胰島素抵抗。2.二甲雙胍在調(diào)節(jié)性早熟伴胰島素抵抗雌鼠糖、脂代謝的同時(shí),改善其胰島素抵抗。3.胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下雌二醇水平升高,脂肪組織及脂肪細(xì)胞芳香化酶表達(dá)水平升高4.二甲雙胍呈劑量依賴性下調(diào)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪組織和脂肪細(xì)胞中芳香化酶的表達(dá)及其基因轉(zhuǎn)錄水平。5.二甲雙胍呈劑量依賴性下調(diào)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下升高的雌激素水平。6.二甲雙胍可能通過MEK/ERK信號通路下調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中芳香化酶的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R725.8

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本文編號：2462573