【摘要】：第一部分極早產兒主要臨床問題回顧性分析 目的： 極早產兒(very preterm infants, VPT,胎齡32wk)由于其解剖生理特點,易發(fā)生各種并發(fā)癥,病死率及后遺癥的發(fā)生率較高,對極早產兒周密的全面管理,是新生兒監(jiān)護病房(NICU)中體現(xiàn)水平的綜合反映。國內在極早產兒NICU救治、預后等方面研究資料匱乏。本研究通過回顧性分析超大容量NICU極早產兒臨床病例資料,旨在了解：(1)極早產兒圍生期特征、NICU中主要疾病構成、治療手段及疾病負擔；(2)極早產兒存活率、主要并發(fā)癥患病比例以及預后的高危因素；(3)新生兒轉運以及超大容量NICU對極早產兒臨床轉歸的影響；(4)國內極早產兒救治現(xiàn)狀與發(fā)達國家救治情況比較。希望通過此文研究為當前極早產兒救治難點、重點提供可靠的臨床研究資料,為更大規(guī)模的極早產兒流行病學研究提供重要的理論依據。 方法： 回顧性收集2010年10月1日至2011年09月30日連續(xù)12個月內,八一兒童醫(yī)院極早產NICU中收治的極早產兒病例資料。病例納入標準：出生胎齡(GA)小于32wk、生后24小時內入住極早產NICU者。 用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料中連續(xù)變量呈正態(tài)分布者表示為均數±標準差,組間均數比較采用t檢驗或單因素方差分析；偏態(tài)分布者表示為中位數(范圍或四分位數間距),組間均數比較采用秩和檢驗。計數資料以發(fā)生率或構成比表示,并對發(fā)生率作區(qū)間估計,發(fā)生率或構成比的比較采用卡方檢驗。因本研究為回顧性分析,結合研究人群特點,采用單因素Logistic回歸模型對極早產兒死亡高危因素分析,進一步運用多因素Logistic回歸模型進行多因素逐步回歸分析以明確死亡的獨立風險因素。變量間相關性采用Spearman等級相關分析。 結果： 1.人口學特征 本次研究共收集病例1262份,符合入選標準的病例729例。其中164例為超早產兒(胎齡,GA≤28wk),占總數的22.5%；478例為極低出生體重兒(VLBW1500g),占總數的65.6%；68例為超低出生體重兒(ELBW1000g),占總數的9.3%。平均GA為29.8±1.4(范圍23.9-31.9)wk。平均出生體重(BW)為1399±285(范圍610-2415)g。男嬰430例,占總的例數的59.0%。76例(10.4%)為小于胎齡兒(SGA),199例(27.3%)為多胎。平均入NICU時齡為2.2±2.3(范圍0.3-24)小時。 2.圍產期特征 544例(74.6%)極早產兒接受了規(guī)律產前檢查,141例(19.3%)產前檢查大于1次或情況不詳。199例(27.3%)應用產前激素,362例(49.7%)剖宮產。153例(21.0%)胎膜早破24h,64例(8.8%)產前抗生素治療。461例(63.3%)的極早產兒母親存在明確妊娠期疾病,包括妊娠高血壓疾病160例(21.9%)、胎膜早破245例(33.6%)、前置胎盤或胎盤早剝72例(9.9%)、糖尿病72例(9.9%)等。213例(29.2%)極早產兒中有的產房用氧復蘇史,其中103例(14.1%)極早產兒接受過氧氣或氣囊加壓給氧,110例(15.1%)極早產兒在產房接受了氣管插管,25例(3.4%)極早產兒接受了產房心臟按壓,14例(1.9%)極早產兒產房復蘇藥物。 3.極早產兒NICU主要疾病構成 極早產兒主要疾病構成與GA、BW成密切相關,胎齡、BW越小,患病比例越高。呼吸系統(tǒng)疾病是極早產兒最常見診斷疾病,主要包括：499例(68.4%)呼吸窘迫綜合癥(RDS),353例(48.4%)新生兒肺炎,61例(8.4%)肺出血,55例(7.5%)新生兒持續(xù)性肺動脈高壓(PPHN),22例(3.0%,,n=606例)支氣管肺發(fā)育不良(BPD),16例(2.2%)氣胸等。其他常見疾病主要有動脈導管未閉(PDA)462例(63.4%),呼吸暫停287例(39.4%),敗血癥92例(12.6%),腦室內出血(IVH)157例(21.5%),腦室周圍白質軟化(PVL)11例(1.5%),壞死性小腸結腸炎(NEC)22例(3.0%),3期以上早產兒視網膜病(ROP)11例(1.7%)等。 4.呼吸系統(tǒng)疾病特征及臨床治療特點 499例RDS極早產兒中,447例(89.6%)接受了肺表面活性物質(PS)治療,66例(13.2%)接受了超過1次的PS治療。應用PS與未使用PS相比,存活率無差異,但PS患兒GA較低、并發(fā)癥比例較高、MV和氧療時間較長；產房使用PS與NICU使用PS相比,兩者GA、存活率、并發(fā)癥、MV和氧療時間等均無顯著差異(P0.05)；與牛源性PS相比,豬源性PS患兒GA、BW更低,住院時間更長,存活率較低但無顯著差異(x2=2.625,P=0.105),主要并發(fā)癥、MV和氧療時間等均無顯著差異(P0.05)。 RDS患兒499例(100%)接受機械通氣(MV),其中79例(15.8%)只接受nCPAP,357例(71.5%)接受常頻機械通氣(CMV,不含HFOV),63例(12.6%)接受HFOV。三種通氣方式中,HFOV存活率最低,MV時間最長,相關疾病或并發(fā)癥比例最高(肺出血、氣胸、重度IVH)；與僅nCPAP相比,CMV除肺出血比例較高外,存活率或主要并發(fā)癥無差異。 358例新生兒肺炎患兒中,57例(16.1%)痰培養(yǎng)陽性,其中培養(yǎng)陽性率較高的有：28例(49.1%)鮑曼不動桿菌,18例(31.6%)肺炎克雷伯菌,6例(10.5%)大腸埃希菌和3例(7.0%)銅綠假單胞菌。 55例PPHN患兒中HFOV的比例為24例(43.6%),吸入NO治療的比例為44例(80.0%)。PPHN與PDA密切相關,接受PDA結扎術患兒中患有PPHN的比例顯著高于非PPHN患兒(16.4%vs1.9%,P0.001)。48例吸入NO的患兒中,8例(16.7%)需要接受PDA結扎術,占所有PDA結扎術患兒(22例)的36.4%。 606例極早產兒糾正胎齡36wk治愈或好轉出院無氧依賴,22例(3.6%)糾正胎齡36wk仍需氧療診斷為BPD。其中7例(31.8%)在生后28天接受激素治療,3例(13.6%)出科時需吸氧,19例(86.4%)治愈出院。 5.其他常見疾病特征及臨床治療特點 極早產兒入住NICU后根據病情需要至少進行1次床旁頭顱超聲。157例(21.5%)IVH是超聲診斷比例最高的疾病,GA越小、BW越低,IVH比例越高。IVH在超早產兒比例為42.1%,VLBW比例為24.3%。 92例敗血癥極早產兒中,血培養(yǎng)陽性70例(76.1%)。其中,肺炎克雷伯菌培養(yǎng)陽性率最高37.1%(26例),其次為葡萄球菌30.0%(21例)、真菌12.9%(9例)、大腸埃希菌7.1%(5例)、鮑曼不動桿菌5.7%(4例)等。 22例NEC患兒中,只有7例(31.8%)接受手術治療,病死率為36.4%(8例)。死亡患兒中3例(37.5%)接受了手術治療,5例(62.5%)選擇了放棄治療。 638例極早產兒在出院或死亡之前至少接受了1次眼底篩查,106例(16.6%)極早產兒有不同程度ROP表現(xiàn),其中127例受檢超早產兒、410例受檢VLBW患兒的檢出比例分別為47.2%(60例)、23.4%(96例)。ROP患兒中11例(10.4%)接受了激光光凝手術治療。與未檢出ROP的存活極早產兒比較,ROP患兒的吸氧時間顯著延長(中位數：26天vs7天,P0.001)；與未接受手術治療的ROP超早產兒相比,接受ROP光凝術的超早產兒氧療時間顯著較長(中位數：44天vs29天,P0.001)。 極早產兒PDA比例按胎齡分層有顯著差異,GA越小,患病比例越高。462例PDA患兒中,380例(82.3%)接受了布洛芬治療,其中130例(34.2%)患兒接受布洛芬治療超過1個療程,GA越小,接受布洛芬治療療程越多。365例接受心臟超聲復查,205例(56.2%)患兒首個療程后PDA閉合,83例(22.7%)的患兒需接受多個療程后PDA閉合；GA越小,PDA閉合的比例越低。22例(4.8%)PDA患兒在接受布洛芬治療后選擇PDA結扎術；GA越小,PDA結扎術的比例越高。82例(17.7%)PDA未接受布洛芬治療,心臟超聲復查PDA自發(fā)性閉合的比例較布洛芬治療的比例高(90.2%vs78.9%,P0.05),但布洛芬治療者GA和BW均較低、合并肺出血的比例較高、接受MV、氧療和住院時間較長以及住院費用較高,存活率無差異。接受多療程布洛芬治療的PDA患兒,GA較低,合并PPHN及吸入NO治療的比例、PDA結扎術的比例均較高,接受MV、氧療和住院時間較長以及住院費用較高,但存活率與1個療程布洛芬PDA患兒相比無差異(92.8%vs94.6%,P=0.495)。 6.極早產兒轉運特點以及對極早產兒臨床轉歸的影響 入選研究對象中,73例(10%)為本院出生新生兒(inborn),656例(90%)為轉運新生兒(outborn)。轉運新生兒入院時齡為2.0小時(中位數),本院出生新生兒為0.5小時(中位數),兩者有顯著性差異；GA、BW無差異(P0.05)。本院出生新生兒剖宮產、胎膜早破24小時比例高于轉運新生兒,而后者多胎比例高于前者(x2=4.173,P=0.041)。轉運新生兒產房搶救措施比例較本院出生新生兒高,但無顯著統(tǒng)計學差異(x2=3.588,P=0.058)。573例(78.6%)極早產兒入NICU前轉運中接受氧療。轉運中氧療模式主要為面罩319例(55.7%)和氣管插管氣囊加壓人工呼吸240例(41.9%)；氧療的比例與GA、BW密切相關,胎齡越小、BW越低,接受氧療比例越高(x2=124.7,P0.001)。 對極早產兒入院后呼吸系統(tǒng)主要疾病、治療措施以及IVH比例比較,轉運新生兒和本院出生新生兒無差異(P0.05)。治愈或好轉出院患兒中轉運新生兒與本院出生新生兒的存活率無差異(91.3%vs94.5%,P=0.384),主要并發(fā)癥比例、MV、氧療和住院時間、住院費用均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 對入院極早產兒按入院時齡2小時(中位數)分層比較,入院時齡≤2h組GA、 BW均無顯著統(tǒng)計學差異。入院時齡2h患兒母親體外人工受精妊娠、妊娠高血壓疾病、規(guī)律產檢、產前激素治療和選擇剖宮產比例顯著高于入院時齡2h組,而后者生后窒息、產房有創(chuàng)性復蘇措施比例較高。入院時齡≤2h組患兒存活率高于入院時齡2h組(91.2%vs84.8%,P0.05),且放棄治療存活出院的比例顯著低于后者(11.2%vs21.7%,P0.01)；存活者中主要并發(fā)癥比例、MV、氧療時間和住院時間以及住院費用等均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 7.死亡、存活者主要并發(fā)癥高危因素分析 極早產兒NICU病死率為8.4%(61例),包括13例(1.8%)院內死亡和48例(6.6%)放棄治療死亡。其中病死率超早產兒為21.3%(35例),VLBW為10.5%(50例),ELBW患兒為26.5%(18例)。GA、BW越低,病死率越高。57例(93.4%)患兒死于新生兒期。 多因素logistic回歸分析表明低GA、有創(chuàng)MV、入院時齡2h、合并氣胸、合并肺出血、未使用PS治療、嚴重先天畸形是極早產兒死亡的獨立高危因素。 8.存活極早產兒住院時間和疾病負擔 存活極早產兒住院時間為43天(中位數),住院費用為46409元(中位數),住院費用大約為同期北京市城市居民年收入的1.4倍。GA越小,住院時間越長、疾病負擔越重。例如,住院時間(中位數)、住院費用(中位數)GA26wk分別為92天、132771元,GA31wk分別為37天、38142元。 9.放棄或姑息治療 131例(18.0%)極早產兒家長放棄或姑息治療,其中67例(51.1%)是由于不能支付繼續(xù)住院治療費用,31例(23.7%)與患兒治療效果差有關,21例(16.0%)是由于伴有嚴重并發(fā)癥,12例(9.2%)是由于嚴重先天性疾病�；純悍艞壷委熀笏烙卺t(yī)院的比例為36.6%(48例)。 10.極早產兒臨床特征與發(fā)達國家比較 本研究中極早產兒產科干預比例與發(fā)達國家相比明顯較低,新生兒轉運比例明顯高于發(fā)達國家,后者以產前轉運為主。極早產兒總體存活率與發(fā)達國家水平相當,但主要并發(fā)癥比例較發(fā)達國家低,分析可能與本院超早產兒的比例低、存活率較低有關。 結論： 1、本研究首次回顧性全面分析了國內超大容量NICU極早產兒病例資料,開創(chuàng)性的總結了國內首個NICU亞�？票O(jiān)護病房極早產兒的救治經驗。研究結果表明極早產兒的救治水平,如89.5%的VLBW患兒治愈或好轉出院,與美國等發(fā)達國家同期NICU中VLBW患兒存活率90%相當。 2、本研究中極早產兒產科主動干預比例(如產前激素應用、剖腹產比例)明顯低于發(fā)達國家水平,而后者大量文獻研究表明極早產兒產前激素應用可以顯著降低極早產兒的病死率和并發(fā)癥比例,因此我們可能在一定程度上延緩了極早產兒搶救時機,影響了極早產兒,特別是超早產兒在NICU中的轉歸。如我院超早產兒存活率為78.7%,與美國(88%)等發(fā)達國家同期水平相比,仍然存在一定的差距。 3、本院已成功建立了目前國內最大的極早產兒轉運中心,所收治極早產兒中,90%通過本院新生兒轉運系統(tǒng)由分娩醫(yī)院主動轉入。眾所周知,極早產兒轉運可能增加死亡和顱內出血等并發(fā)癥風險,但本研究結果表明轉運新生兒和本院出生新生兒的存活率、主要并發(fā)癥比例無顯著差異,提示通過完善的轉運網絡,短距離、2小時內新生兒轉運以及區(qū)域性大規(guī)模的Ⅲ級NICU救治可以將轉運相關的不良事件降至最低。 4、極早產兒,特別是超早產兒的預后差風險高、疾病負擔重,患兒家長救治意識(擔心預后)以及社會、家庭經濟水平嚴重影響這些患兒的預后。 第二部分人臍帶血間充質干細胞制備研究 目的： 間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是干細胞家族的重要成員,具有高度增殖、自我更新能力,廣泛分布于骨髓、臍帶血、臍帶、胎盤等各種組織中。由于臍帶血來源豐富,采集方便,排斥小,無倫理爭議等優(yōu)點,臍帶血來源MSCs作為新生兒嚴重疾病移植用種子細胞受到重視。然而,臍帶血(Umbilical Cord Blood, UCB) MSCs分離培養(yǎng)成功率低,目前對于如何從臍帶血中獲取MSCs仍存在爭議。本研究的目的：(1)研究UCB-MSCs其體外分離、純化及培養(yǎng)條件,并對其進行生物學特性進行鑒定,建立了穩(wěn)定的UCB-MSCs培養(yǎng)體系。(2)明確不同GA來源UCB-MSCs培養(yǎng)成功率是否有差異。 方法： (1)無菌條件下收集新鮮健康新生兒UCB,采用密度梯度離心法結合直接貼壁法體外分離UCB-MSCs,加入含體積分數為10%人胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,調整細胞密度為1×1011/L接種于胎牛血清包被過的塑料培養(yǎng)瓶中,置于37℃、體積分數為5%的C02飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。當培養(yǎng)瓶中的細胞生長到80%融合時,胰酶-EDTA混合液消化傳代。觀察貼壁細胞的形態(tài)學特征,計算累積群體倍增水平,應用流式細胞技術分析細胞增殖活性、免疫表型,特異性染色方法鑒定細胞的多向分化潛能。(2)將UCB依GA分為3組：足月兒組(GA36周；n=16)；早產兒組(GA32-36周；n=11)；極早產兒組(GA32周；n=9)。采取相對適應的條件培養(yǎng),觀察能成功培養(yǎng)出MSCs的比率,探討GA、UCB采集量、UCB單核細胞(monocuclear cells,MNCs)數量對MSCs培養(yǎng)成功率的影響。 結果： (1)UCB-單核細胞分離接種4-5d后開始可見有少量細胞貼壁,后貼壁細胞逐漸增多,并出現(xiàn)少量梭形和多角形細胞,2周后可見細胞形成集落,培養(yǎng)4-5周呈現(xiàn)融合。第2代細胞接種后24h內開始貼壁,2周左右即可達80%～90%融合。流式細胞儀細胞表面分子標記檢測,此類細胞穩(wěn)定地表達相關MSCs抗原標記CD105、CD90、CD73和HLA-ABC,但不表達造血干細胞標志物CD14、CD34和CD45。經特殊培養(yǎng)基誘導細胞分化實驗證實成功向軟骨、脂肪分化。傳代15代以內細胞數擴增能力逐漸降低,第3代至第7代擴增能力較明顯。流式細胞儀細胞周期及細胞凋亡檢測表明細胞增殖力和生長均良好。細胞反復凍存復蘇后細胞生物特性穩(wěn)定。 (2)GA、UCB采集量、MNCs數量對UCB-MSCs培養(yǎng)成功與否的有顯著影響：①UCB-MSCs培養(yǎng)成功率為52.8%,成功者GA明顯小于未成功者(34.0±4.2vs36.8±3.3wk;t=2.184,P=0.036),MSCs培養(yǎng)成功率隨GA增加呈降低趨勢,差異無顯著統(tǒng)計學意義(x2=3.769,P=0.152)。②成功者采血量顯著高于未成功者(43.2±13.6vs32.1±11.5ml;t=2.635,P=0.013)。成功者不同GA間UCB采血量有顯著差異(F=4.003,P=0.039),GA越大,采血量越多。③成功培養(yǎng)MSCs的樣本單位體積內MNCs數顯著高于未培養(yǎng)出MSCs的樣本(32.9±11.7vs23.7±6.5×106/ml；t=2.863,P=0.008)；成功者不同GA間UCB單位體積內MNCs數無顯著差異(F=1.087,P=0.361)。④按GA分層對MSCs產率比較,結果發(fā)現(xiàn)三組間有顯著性統(tǒng)計學差異(F=13.309,P=0.000):GA越小,MSCs產率越高。 結論： (1)本實驗通過對傳統(tǒng)方法的優(yōu)化,根據細胞生長形態(tài)、細胞表明標記分子以及體外分化實驗結果表明我們成功分離UCB-MSCs,同時體外擴增可以獲得豐量的UCB-MSCs,細胞經凍存后復蘇培養(yǎng)、反復傳代后檢測細胞生物學特性穩(wěn)定,表明我們已建立了穩(wěn)定的UCB-MSCs培養(yǎng)體系。 (2)UCB培養(yǎng)成功率仍較低,其中GA.UCB采集量、MNCs數量對UCB-MSCs培養(yǎng)成功與否的有顯著影響。小胎齡、UCB采集量越多、單位體積內MNCs數量越多等可能是UCB-MSCs相對容易培養(yǎng)成功的原因。小胎齡UCB-MSCs產率高于大胎齡,提示小胎齡UCB可能是更佳的MSCs體外分離培養(yǎng)來源。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R722.6

【參考文獻】

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本文編號：2461935