發(fā)布時間：2019-03-15 22:27

【摘要】：肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, SP)是人類最早認識的革蘭陽性雙球菌,從新生兒至兒童期SP的定植率可達30～100%,導致人類各種肺炎鏈球菌相關(guān)性疾病(Pneumococcal disease, PD):如全身嚴重侵襲性感染,以及局部粘膜感染,是全球范圍內(nèi)最常見和首要的導致社區(qū)獲得性肺炎(Community-acquired pneumonia, CAP)的病原體。 兒童和長者、慢性病、酗酒、免疫力低下者易出現(xiàn)SP的嚴重感染和高病死率,PD是5歲以下兒童的首要死因,全球每年約100萬嬰幼兒死于該病,其中發(fā)展中國家受累最重,非洲、亞洲兒童PD的死亡率占全球的95%,我國PD死亡兒童人數(shù)列全球前10名以內(nèi),由于人口流動、多重耐藥性傳播等因素,全球PD負擔尚在不斷加重,防治壓力巨大。 SP強大的致病和定植能力與其實際存在超過90種的血清型(serotype)/變種(variant)有關(guān),決定血清型特異性的是SP細胞外包繞的莢膜多糖(Capsular polysaccharide, CPS),是SP最重要的毒力因子和致病的關(guān)鍵,其可作為宿主抗體的作用靶點,這也是疫苗應用的基礎(chǔ)。迄今,根據(jù)SP的不同CPS結(jié)構(gòu),采用免疫學方法已經(jīng)鑒定出46個血清群(serogroup),93個血清型。 SP的血清型與其致病性、耐藥性和疫苗有效性等均密切相關(guān),是防治PD相關(guān)研究的核心。全球范圍內(nèi),13種血清型導致了超過75%的兒童侵襲性PD(Invasive pneumococcal disease, IPD);多項研究顯示SP多重耐藥菌(Multidrug resistance, MDR)在全球廣泛流行,亞洲國家最顯著,我國MDRSP高達80～90%以上,由于選擇壓力,流行血清型更具有耐藥性,為更好的控制耐藥流行SP的傳播,目前已有多種針對不同血清型的疫苗,可供2歲以下兒童使用的7價結(jié)合疫苗(Pneumococcal conj ugate vaccine, PCV)全球應用最早最廣。應用PCV7之初,顯著降低了IPD的發(fā)病率及耐藥血清型的流行,隨后全球各地均出現(xiàn)不同程度的SP非疫苗血清型(Nonvaccine serotype, NVT)增加,總體PD的發(fā)病率不再顯著降低,疫苗的有效性和研發(fā)新型疫苗是目前國際相關(guān)研究關(guān)注的焦點。 SP的血清型分布流行特點尚具有顯著的地域、年齡差別,并隨時間、環(huán)境變遷、人群流動、抗菌素壓力、細菌進化和重組等多種因素出現(xiàn)不同時期流行血清型的飄移(Serotype swift),因此,持續(xù)監(jiān)測SP的血清型流行分布及改變特征,與研究SP的致病機制、耐藥性傳播、血清型置換等實驗和臨床研究都息息相關(guān),對防治PD具有重要的流行病學意義。 目前檢測SP血清型的金標準是通過126種CPS兔抗血清,采用棋盤篩選方式,將SP進行血清分群和分型(可以區(qū)分91種血清型),但檢測費用極昂貴,并且手工操作復雜、費時,結(jié)果判斷主觀,均限制其在大部分臨床實驗室的應用,不能適應以發(fā)展中國家和地區(qū)為首的對血清型檢測的廣泛需求。 隨著SP的93種血清型的cps序列的公布,各種分子分型技術(shù)有望替代傳統(tǒng)方法,針對cps序列不同靶基因的多種聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)再輔助后續(xù)的不同產(chǎn)物分離以區(qū)分不同血清型的分子方法不斷被探索。其中,美國CDC推薦采用的多重PCR (mutiple-PCR, mPCR)檢測SP血清型的方案較為經(jīng)濟、快速、靈活和有效,目前得到全球多個研究者的采用,該方案最大的缺點是一次mPCR包括的引物對僅2-4對,需要7-8次連續(xù)mPCR才能鑒定出多種血清型,且通過電泳分析產(chǎn)物容易造成污染。 因此,本研究擬建立并完善高通量、高特異性且簡易經(jīng)濟、可靠客觀的檢測SP血清型體系使其能廣泛應用于臨床實驗室。 多重連接酶依賴的探針擴增法(Multiplex Ligation-dependent Probe Amp-lification, MLPA)是一種針對多種待檢DNA序列進行定性和半定量分析的基于特異性探針連接的PCR新技術(shù),基本原理包括探針和靶序列DNA進行序列特異性雜交,連接酶連接、通用引物對所有完成連接的序列進行PCR擴增,產(chǎn)物分離及數(shù)據(jù)分析,其特點是在一次反應中通過多重特異性探針可檢測40-50個核苷酸序列,連接酶保證反應的特異性,且后續(xù)只需要一個通用引物即可進行PCR擴增,具有高通量、高特異性和簡易經(jīng)濟的特點,目前已經(jīng)應用于多個領(lǐng)域、多種疾病的研究,包括染色體非整倍體改變,單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)和點突變,多種呼吸道病毒的檢測,尚未見報道用于細菌血清型分型檢測。 MLPA的技術(shù)難點在于設(shè)計特異性雜交探針,模板DNA必須與兩條特異性探針(長探針和短探針)均完全互補才能進行后續(xù)的連接和PCR擴增,因此可檢測出一個堿基的差異,理論上很適于檢測SP不同血清型cps間具有的異質(zhì)性差異,MLPA后續(xù)產(chǎn)物的分析通常采用毛細管凝膠電泳,根據(jù)產(chǎn)物的大小區(qū)別,檢測成本較高,耗時并有開蓋產(chǎn)物污染風險。 本課題組對MLPA探針及后續(xù)產(chǎn)物分析進行改進,通過設(shè)計新型的基于與MLPA長探針上的填充序列相同的具有特定Tm的值熒光檢測探針加入體系以標記不同MLPA探針反義鏈,在PCR擴增完成后,通過不同的熒光檢測探針的融解曲線分析檢測是否有相應血清型擴增產(chǎn)物,實現(xiàn)單管不開蓋檢測產(chǎn)物,極大的優(yōu)化實驗步驟,使其更適于臨床菌株血清型檢測。 本研究結(jié)合PCV7疫苗血清型和國內(nèi)已有流行血清型分布研究結(jié)果,建立并完成優(yōu)化常見的十種血清型的新型多重熒光探針法檢測體系,一次完成對血清型4、6、9V/9A、14、15A/F、15B/C、18(18A/18B/18C/18F、19A、19F、23F的檢測,并對其進行臨床菌株應用評價。 第一章建立新型多重熒光探針法檢測肺炎鏈球菌血清型體系 首先,參考美國CDC網(wǎng)站(http://www.cdc.gv/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)公布信息,構(gòu)建了十種血清型特異性PCR檢測體系和3個mPCR檢測體系,并構(gòu)建完成十種血清型特異性質(zhì)粒用于后續(xù)實驗標準品；通過檢測二十種已知血清型、SP血清型特異性質(zhì)粒完善和優(yōu)化檢測體系,以完成對十種血清型的PCR對照檢測,使其可以應用于臨床菌株血清型對照檢測。 其次,建立新型多重熒光探針法檢測十種血清型體系：設(shè)計十種血清型特異性MLPA探針、十種血清型特異性熒光檢測探針,兩種內(nèi)標MLPA探針及熒光檢測探針。血清型特異性MLPA探針由左探針和右探針組成,左探針包括一段通用引物結(jié)合序列和一段血清型特異性寡核苷酸(LPO),右探針包括一段血清型特異性寡核苷酸(RPO)、一段填充序列(該序列與熒光檢測探針序列相同)和一段通用引物結(jié)合序列。LPO和RPO序列部分的Tm值為70度左右,RPO的5’端磷酸化。當LPO和RPO雜交序列與待檢測DNA特異性互補雜交,經(jīng)連接酶連接后,左右兩探針相連成為一個完整模板DNA,在通用引物的作用下,經(jīng)不對稱PCR擴增出大量產(chǎn)物DNA和與模板DNA互補的單鏈DNA。該雜交序列是參考美國CDC網(wǎng)站(http://www.cdc.gv/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)公布的特異性血清型引物序列,再通過BLAST獲取擴增產(chǎn)物序列,在產(chǎn)物序列里面篩選Tm值恰當,無SNP位點為雜交序列。填充序列為與鏈球菌基因組無特異性結(jié)合的序列,不同填充序列與熒光探針對應,其Tm為特定值,用于區(qū)分不同擴增產(chǎn)物。通用引物結(jié)合序列參考文獻確定,填充序列參考文獻根據(jù)(G+C)的Tm值確定。血清型特異性熒光檢測探針序列與填充序列相同,其3’-最后一個堿基標有ROX/CY5熒光基團。 全體系中只有1對通用引物,設(shè)計為不對稱PCR,檢測體系中還包括雜交緩沖液、連接PCR體系。整個體系實驗流程包括雜交探針與靶DNA雜交,連接酶將已雜交的LPO和RPO連接,PCR完成對整個MLPA探針序列進行擴增,熒光融解曲線分析血清型熒光檢測探針完成對血清型特異性產(chǎn)物的檢測。 再次,完成優(yōu)化新型多重熒光探針檢測體系并評估其靈敏度、特異性和重復性：應用SP血清型特異性質(zhì)粒、二十種已知血清型(包括十種檢測體系內(nèi)血清型和十種檢測體系外血清型)SP菌株及多種其它非SP菌株DNA作為檢測標準,對整個體系及實驗流程的進行優(yōu)化,優(yōu)化完成體系的檢測靈敏度為103copies/ml,確定熒光探針融解曲線峰值0.1為陽性血清型特異性峰；可正確分辨出所有十種已知血清型,每個已知血清型檢測結(jié)果均具有3個陽性峰：血清型特異性峰,兩個內(nèi)標峰；采用十種檢測體系外血清型和其它非SP菌株DNA進行特異性檢測,未發(fā)現(xiàn)血清型特異性檢測峰及內(nèi)標峰,特異性良好,4個濃度重復檢測十種已知血清型菌株DNA顯示均能檢測出相同陽性結(jié)果,重復性良好。 本研究建立的新型多重熒光探針法檢測常見SP血清型體系符合臨床檢測SP血清型的簡易、高效、經(jīng)濟、高通量的要求,實現(xiàn)不開蓋單管完成對十種血清型檢測,初步估計應用該體系檢測一株SP的血清型造價是采用傳統(tǒng)金標準方法檢測的十分之一以上,檢測時間約3小時,有很好的臨床應用前景。 第二章新型多重熒光探針法檢測肺炎鏈球菌血清型的臨床應用評價 本研究對臨床收集的侵襲性SP菌株30例、呼吸道SP菌株180例分別進行4種方法(傳統(tǒng)方法、新型多重熒光探針法、mPCR法、血清型特異性PCR+測序法)和3種方法(新型多重熒光探針法、mPCR法、血清型特異性PCR+測序法)檢測十種血清型,以評估新型多重熒光探針法檢測SP菌株血清型的臨床應用價值。 30例侵襲性SP菌株血清型檢測結(jié)果顯示,新型多重熒光探針法一次可以檢測出全部菌株血清型共6種：9例19F(30%)、7例23F(23.3%)、7例14型(23.3%)、3例6型(10%)、2例15B(6.7%)、2例19A(6.7%),一份樣本只檢出一種血清型,檢測敏感性為100%,每種血清型的檢測特異性為100%,結(jié)果與其他三種方法完全一致,完成對所有菌株血清型的檢測需進行3次mPCR； 180例呼吸道SP菌株血清型檢測結(jié)果顯示,新型多重熒光探針法一次可以檢測出93.3%菌株的血清型(168/180),其中檢出19F最多,占29.4%(53),其次為：23F16.1%(29)、6型15%(27)19A11.7%(21),15B5.6%(10)、14型3.3%(4),15A、18C、9V、4各占0.6%(1),檢出兩種血清型混合感染占10%(18),未檢出相關(guān)血清型6.7%(12),新型多重熒光探針法與金標準血清型特異性PCR+測序方法檢測結(jié)果無顯著性差異,一致性強(Kappa=0.845, P=0.000),與mPCR方法檢測結(jié)果無顯著性差異,一致性強(Kappa=0.863, P=0.000);新型多重熒光探針法和mPCR法檢測呼吸道SP菌株十種血清型的準確性相同,敏感性97.6%、特異性100%、陽性預測值100%、陰性預測值75%。新型多重熒光探針法檢測呼吸道菌株單種血清型感染的敏感性、特異性均為100%,mPCR法的檢測敏感性、特異性為98.6%、100%。對22例具有兩種血清型混合感染菌株分析顯示,以6/19F混合感染最多(12),23F可與多種血清型混合感染(共4種),新型多重熒光探針法和mPCR方法對混合感染的菌株血清型檢測敏感性均為81.8%(18/22),特異性均為100%(158/158),陽性預測值均為100%(18/18),陰性預測值新型多重熒光探針法、mPCR法為97.6%(158/162)、98.8%(160/162)；新型多重熒光探針法與mPCR方法檢測混合血清型的一致性好(Kappa=0.941, P=0.000),兩方法無顯著性差異(McNemar P=0.5);新型多重熒光探針法與金標準法檢測混合血清型的一致性好(Kappa=0.888, P=0.000),兩方法無顯著性差異(McNemar P=0.125)。經(jīng)分別比較侵襲性和呼吸道SP菌株檢出血清型6、14、19F、23F、15B、19A的陽性率,血清型14在侵襲性菌株中的陽性率23.3%顯著高于呼吸道菌株中的陽性率3.3%,差異有顯著性(x2=14.435, v=1,P=0.001),其他血清型在兩種樣本中分布未見顯著性差異。不包括檢出混合血清型,三組mPCR方法每一組mPCR分別檢出侵襲性SP菌株血清型覆蓋率為36.7%、46.7%、16.7%,三組mPCR方法每一組mPCR分別可檢出呼吸道SP菌株血清型覆蓋率為39.4%、19.4%、21.1%。 4種檢測血清型方法中,本研究新型多重熒光探針法平均花費約10元／例,遠低于傳統(tǒng)方法167元／例,檢測十種血清型完成時間最快3小時,遠比測序法3天時間短,只需要一次PCR,采用熒光定量PCR儀直接觀察結(jié)果,無污染、高通量,操作最簡單。檢測臨床菌株的準確性與mPCR法一致,整個體系穩(wěn)定,適用于臨床大量SP菌株的血清型初篩檢測。 第三章深圳市寶安區(qū)臨床SP菌株檢出血清型分布特點與疫苗覆蓋率 本研究采用血清型1/3/5/7F特異性PCR補充檢測第二章中的未知血清型菌株,對第二章中的臨床SP菌株檢出血清型進行分布特點與疫苗覆蓋率的流行病學分析,結(jié)果顯示： 首先,侵襲性菌株和呼吸道菌株檢出血清型的PCV7/13疫苗覆蓋率較高,分別為86.7%/93.3%和74.4%/86.1%(細分兩種混合感染血清型結(jié)果后),不同樣本類型的疫苗覆蓋率之間沒有顯著性差異；呼吸道菌株檢出兩種混合感染血清型能被PCV7和PCV13覆蓋的比例相同,均為81.8%,兩種混合感染血清型分別表現(xiàn)為6+19F/6+23F/23F+19F,其余18.2%不能完全被PCV7或PCV13覆蓋,如排除兩種混合感染血清型結(jié)果,則侵襲性菌株的PCV7/13疫苗覆蓋率均顯著高于呼吸道菌株； 其次,侵襲性和呼吸道SP中非PCV7疫苗血清型分布特點：侵襲性SP中共計4例為非PCV7疫苗血清型(13.3%),其中有PCV13疫苗血清型19A2例與非PCV13疫苗血清型15B2例；呼吸道SP中共計46例為非PCV7疫苗血清型(25.6%),其中有PCV13疫苗血清型19A(43.5%)和5型(2.2%)共計45.7%；其他非PCV13疫苗血清型共計54.3%,其中與15B有關(guān)的可達26.1%(包括15B+23F2.2%,15B+19A2.2%,15B21.7%),與15A有關(guān)的占4.4%(15A+23F),與PCV7疫苗血清型23F有關(guān)的占6.7%(15A+23F4.4%,15B+23F2.2%)；與19A有關(guān)的共計45.7%(19A43.5%,15B+19A2.2%)；非PCV13未知型(除外15A/15B)23.9%。 因此,通過本研究方法對臨床菌株血清型的檢測,能基本闡述本地區(qū)菌株的血清型分布特點,說明本研究方法對臨床菌株的血清型的檢測具有重要的流行病學分析的價值。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R725.6;R440

【參考文獻】

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1 趙瑞珍;鄭躍杰;鄧秋蓮;王紅梅;陳乾;鄧繼巋;;廣東省深圳社區(qū)獲得性肺炎患兒肺炎鏈球菌的血清群/型的分布及其耐藥性[J];中國感染與化療雜志;2010年03期

2 張?zhí)鞐?張泓;;肺炎鏈球菌流行病學研究進展[J];中國感染與化療雜志;2012年06期

3 黎全華;楊永弘;;兒童肺炎鏈球菌感染的防治進展[J];臨床藥物治療雜志;2013年01期

4 姚開虎;王立波;趙根明;鄭躍杰;鄧力;趙瑞珍;鄧秋蓮;胡英惠;俞桑潔;沈敘莊;楊永弘;;北京上海廣州深圳4家兒童醫(yī)院肺炎住院患兒肺炎鏈球菌分離株的血清型分布[J];中國循證兒科雜志;2008年06期

5 佟月娟;姚開虎;俞桑潔;李燕;楊永弘;;上呼吸道感染患兒肺炎鏈球菌血清群/型及耐藥分析[J];中國計劃免疫;2007年01期

6 任紅宇;王曉蕾;李馬超;張礪;高源;邵祝軍;;123株肺炎鏈球菌血清分型及耐藥性研究[J];中國疫苗和免疫;2010年01期

7 李馬超;張麒;任紅宇;周海健;李倩;邵祝軍;;我國部分地區(qū)肺炎鏈球菌血清分型與脈沖場凝膠電泳分型分析[J];中國疫苗和免疫;2010年03期

8 姚開虎;陸權(quán);鄧力;俞桑潔;張泓;鄧秋蓮;佟月娟;高薇;袁林;沈敘莊;楊永弘;;2000-2002年三家兒童醫(yī)院分離的肺炎鏈球菌血清型分布及其對β內(nèi)酰胺類抗生素敏感性的變化[J];中華兒科雜志;2006年12期

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本文編號：2441037