【摘要】：肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, SP)是人類最早認(rèn)識(shí)的革蘭陽性雙球菌,從新生兒至兒童期SP的定植率可達(dá)30～100%,導(dǎo)致人類各種肺炎鏈球菌相關(guān)性疾病(Pneumococcal disease, PD):如全身嚴(yán)重侵襲性感染,以及局部粘膜感染,是全球范圍內(nèi)最常見和首要的導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎(Community-acquired pneumonia, CAP)的病原體。 兒童和長者、慢性病、酗酒、免疫力低下者易出現(xiàn)SP的嚴(yán)重感染和高病死率,PD是5歲以下兒童的首要死因,全球每年約100萬嬰幼兒死于該病,其中發(fā)展中國家受累最重,非洲、亞洲兒童PD的死亡率占全球的95%,我國PD死亡兒童人數(shù)列全球前10名以內(nèi),由于人口流動(dòng)、多重耐藥性傳播等因素,全球PD負(fù)擔(dān)尚在不斷加重,防治壓力巨大。 SP強(qiáng)大的致病和定植能力與其實(shí)際存在超過90種的血清型(serotype)/變種(variant)有關(guān),決定血清型特異性的是SP細(xì)胞外包繞的莢膜多糖(Capsular polysaccharide, CPS),是SP最重要的毒力因子和致病的關(guān)鍵,其可作為宿主抗體的作用靶點(diǎn),這也是疫苗應(yīng)用的基礎(chǔ)。迄今,根據(jù)SP的不同CPS結(jié)構(gòu),采用免疫學(xué)方法已經(jīng)鑒定出46個(gè)血清群(serogroup),93個(gè)血清型。 SP的血清型與其致病性、耐藥性和疫苗有效性等均密切相關(guān),是防治PD相關(guān)研究的核心。全球范圍內(nèi),13種血清型導(dǎo)致了超過75%的兒童侵襲性PD(Invasive pneumococcal disease, IPD);多項(xiàng)研究顯示SP多重耐藥菌(Multidrug resistance, MDR)在全球廣泛流行,亞洲國家最顯著,我國MDRSP高達(dá)80～90%以上,由于選擇壓力,流行血清型更具有耐藥性,為更好的控制耐藥流行SP的傳播,目前已有多種針對(duì)不同血清型的疫苗,可供2歲以下兒童使用的7價(jià)結(jié)合疫苗(Pneumococcal conj ugate vaccine, PCV)全球應(yīng)用最早最廣。應(yīng)用PCV7之初,顯著降低了IPD的發(fā)病率及耐藥血清型的流行,隨后全球各地均出現(xiàn)不同程度的SP非疫苗血清型(Nonvaccine serotype, NVT)增加,總體PD的發(fā)病率不再顯著降低,疫苗的有效性和研發(fā)新型疫苗是目前國際相關(guān)研究關(guān)注的焦點(diǎn)。 SP的血清型分布流行特點(diǎn)尚具有顯著的地域、年齡差別,并隨時(shí)間、環(huán)境變遷、人群流動(dòng)、抗菌素壓力、細(xì)菌進(jìn)化和重組等多種因素出現(xiàn)不同時(shí)期流行血清型的飄移(Serotype swift),因此,持續(xù)監(jiān)測SP的血清型流行分布及改變特征,與研究SP的致病機(jī)制、耐藥性傳播、血清型置換等實(shí)驗(yàn)和臨床研究都息息相關(guān),對(duì)防治PD具有重要的流行病學(xué)意義。 目前檢測SP血清型的金標(biāo)準(zhǔn)是通過126種CPS兔抗血清,采用棋盤篩選方式,將SP進(jìn)行血清分群和分型(可以區(qū)分91種血清型),但檢測費(fèi)用極昂貴,并且手工操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí),結(jié)果判斷主觀,均限制其在大部分臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用,不能適應(yīng)以發(fā)展中國家和地區(qū)為首的對(duì)血清型檢測的廣泛需求。 隨著SP的93種血清型的cps序列的公布,各種分子分型技術(shù)有望替代傳統(tǒng)方法,針對(duì)cps序列不同靶基因的多種聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)再輔助后續(xù)的不同產(chǎn)物分離以區(qū)分不同血清型的分子方法不斷被探索。其中,美國CDC推薦采用的多重PCR (mutiple-PCR, mPCR)檢測SP血清型的方案較為經(jīng)濟(jì)、快速、靈活和有效,目前得到全球多個(gè)研究者的采用,該方案最大的缺點(diǎn)是一次mPCR包括的引物對(duì)僅2-4對(duì),需要7-8次連續(xù)mPCR才能鑒定出多種血清型,且通過電泳分析產(chǎn)物容易造成污染。 因此,本研究擬建立并完善高通量、高特異性且簡易經(jīng)濟(jì)、可靠客觀的檢測SP血清型體系使其能廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室。 多重連接酶依賴的探針擴(kuò)增法(Multiplex Ligation-dependent Probe Amp-lification, MLPA)是一種針對(duì)多種待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的基于特異性探針連接的PCR新技術(shù),基本原理包括探針和靶序列DNA進(jìn)行序列特異性雜交,連接酶連接、通用引物對(duì)所有完成連接的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物分離及數(shù)據(jù)分析,其特點(diǎn)是在一次反應(yīng)中通過多重特異性探針可檢測40-50個(gè)核苷酸序列,連接酶保證反應(yīng)的特異性,且后續(xù)只需要一個(gè)通用引物即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增,具有高通量、高特異性和簡易經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),目前已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多種疾病的研究,包括染色體非整倍體改變,單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)和點(diǎn)突變,多種呼吸道病毒的檢測,尚未見報(bào)道用于細(xì)菌血清型分型檢測。 MLPA的技術(shù)難點(diǎn)在于設(shè)計(jì)特異性雜交探針,模板DNA必須與兩條特異性探針(長探針和短探針)均完全互補(bǔ)才能進(jìn)行后續(xù)的連接和PCR擴(kuò)增,因此可檢測出一個(gè)堿基的差異,理論上很適于檢測SP不同血清型cps間具有的異質(zhì)性差異,MLPA后續(xù)產(chǎn)物的分析通常采用毛細(xì)管凝膠電泳,根據(jù)產(chǎn)物的大小區(qū)別,檢測成本較高,耗時(shí)并有開蓋產(chǎn)物污染風(fēng)險(xiǎn)。 本課題組對(duì)MLPA探針及后續(xù)產(chǎn)物分析進(jìn)行改進(jìn),通過設(shè)計(jì)新型的基于與MLPA長探針上的填充序列相同的具有特定Tm的值熒光檢測探針加入體系以標(biāo)記不同MLPA探針反義鏈,在PCR擴(kuò)增完成后,通過不同的熒光檢測探針的融解曲線分析檢測是否有相應(yīng)血清型擴(kuò)增產(chǎn)物,實(shí)現(xiàn)單管不開蓋檢測產(chǎn)物,極大的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟,使其更適于臨床菌株血清型檢測。 本研究結(jié)合PCV7疫苗血清型和國內(nèi)已有流行血清型分布研究結(jié)果,建立并完成優(yōu)化常見的十種血清型的新型多重?zé)晒馓结樂z測體系,一次完成對(duì)血清型4、6、9V/9A、14、15A/F、15B/C、18(18A/18B/18C/18F、19A、19F、23F的檢測,并對(duì)其進(jìn)行臨床菌株應(yīng)用評(píng)價(jià)。 第一章建立新型多重?zé)晒馓结樂z測肺炎鏈球菌血清型體系 首先,參考美國CDC網(wǎng)站(http://www.cdc.gv/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)公布信息,構(gòu)建了十種血清型特異性PCR檢測體系和3個(gè)mPCR檢測體系,并構(gòu)建完成十種血清型特異性質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品；通過檢測二十種已知血清型、SP血清型特異性質(zhì)粒完善和優(yōu)化檢測體系,以完成對(duì)十種血清型的PCR對(duì)照檢測,使其可以應(yīng)用于臨床菌株血清型對(duì)照檢測。 其次,建立新型多重?zé)晒馓结樂z測十種血清型體系：設(shè)計(jì)十種血清型特異性MLPA探針、十種血清型特異性熒光檢測探針,兩種內(nèi)標(biāo)MLPA探針及熒光檢測探針。血清型特異性MLPA探針由左探針和右探針組成,左探針包括一段通用引物結(jié)合序列和一段血清型特異性寡核苷酸(LPO),右探針包括一段血清型特異性寡核苷酸(RPO)、一段填充序列(該序列與熒光檢測探針序列相同)和一段通用引物結(jié)合序列。LPO和RPO序列部分的Tm值為70度左右,RPO的5’端磷酸化。當(dāng)LPO和RPO雜交序列與待檢測DNA特異性互補(bǔ)雜交,經(jīng)連接酶連接后,左右兩探針相連成為一個(gè)完整模板DNA,在通用引物的作用下,經(jīng)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增出大量產(chǎn)物DNA和與模板DNA互補(bǔ)的單鏈DNA。該雜交序列是參考美國CDC網(wǎng)站(http://www.cdc.gv/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)公布的特異性血清型引物序列,再通過BLAST獲取擴(kuò)增產(chǎn)物序列,在產(chǎn)物序列里面篩選Tm值恰當(dāng),無SNP位點(diǎn)為雜交序列。填充序列為與鏈球菌基因組無特異性結(jié)合的序列,不同填充序列與熒光探針對(duì)應(yīng),其Tm為特定值,用于區(qū)分不同擴(kuò)增產(chǎn)物。通用引物結(jié)合序列參考文獻(xiàn)確定,填充序列參考文獻(xiàn)根據(jù)(G+C)的Tm值確定。血清型特異性熒光檢測探針序列與填充序列相同,其3’-最后一個(gè)堿基標(biāo)有ROX/CY5熒光基團(tuán)。 全體系中只有1對(duì)通用引物,設(shè)計(jì)為不對(duì)稱PCR,檢測體系中還包括雜交緩沖液、連接PCR體系。整個(gè)體系實(shí)驗(yàn)流程包括雜交探針與靶DNA雜交,連接酶將已雜交的LPO和RPO連接,PCR完成對(duì)整個(gè)MLPA探針序列進(jìn)行擴(kuò)增,熒光融解曲線分析血清型熒光檢測探針完成對(duì)血清型特異性產(chǎn)物的檢測。 再次,完成優(yōu)化新型多重?zé)晒馓结槞z測體系并評(píng)估其靈敏度、特異性和重復(fù)性：應(yīng)用SP血清型特異性質(zhì)粒、二十種已知血清型(包括十種檢測體系內(nèi)血清型和十種檢測體系外血清型)SP菌株及多種其它非SP菌株DNA作為檢測標(biāo)準(zhǔn),對(duì)整個(gè)體系及實(shí)驗(yàn)流程的進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化完成體系的檢測靈敏度為103copies/ml,確定熒光探針融解曲線峰值0.1為陽性血清型特異性峰；可正確分辨出所有十種已知血清型,每個(gè)已知血清型檢測結(jié)果均具有3個(gè)陽性峰：血清型特異性峰,兩個(gè)內(nèi)標(biāo)峰；采用十種檢測體系外血清型和其它非SP菌株DNA進(jìn)行特異性檢測,未發(fā)現(xiàn)血清型特異性檢測峰及內(nèi)標(biāo)峰,特異性良好,4個(gè)濃度重復(fù)檢測十種已知血清型菌株DNA顯示均能檢測出相同陽性結(jié)果,重復(fù)性良好。 本研究建立的新型多重?zé)晒馓结樂z測常見SP血清型體系符合臨床檢測SP血清型的簡易、高效、經(jīng)濟(jì)、高通量的要求,實(shí)現(xiàn)不開蓋單管完成對(duì)十種血清型檢測,初步估計(jì)應(yīng)用該體系檢測一株SP的血清型造價(jià)是采用傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)方法檢測的十分之一以上,檢測時(shí)間約3小時(shí),有很好的臨床應(yīng)用前景。 第二章新型多重?zé)晒馓结樂z測肺炎鏈球菌血清型的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià) 本研究對(duì)臨床收集的侵襲性SP菌株30例、呼吸道SP菌株180例分別進(jìn)行4種方法(傳統(tǒng)方法、新型多重?zé)晒馓结樂�、mPCR法、血清型特異性PCR+測序法)和3種方法(新型多重?zé)晒馓结樂āPCR法、血清型特異性PCR+測序法)檢測十種血清型,以評(píng)估新型多重?zé)晒馓结樂z測SP菌株血清型的臨床應(yīng)用價(jià)值。 30例侵襲性SP菌株血清型檢測結(jié)果顯示,新型多重?zé)晒馓结樂ㄒ淮慰梢詸z測出全部菌株血清型共6種：9例19F(30%)、7例23F(23.3%)、7例14型(23.3%)、3例6型(10%)、2例15B(6.7%)、2例19A(6.7%),一份樣本只檢出一種血清型,檢測敏感性為100%,每種血清型的檢測特異性為100%,結(jié)果與其他三種方法完全一致,完成對(duì)所有菌株血清型的檢測需進(jìn)行3次mPCR； 180例呼吸道SP菌株血清型檢測結(jié)果顯示,新型多重?zé)晒馓结樂ㄒ淮慰梢詸z測出93.3%菌株的血清型(168/180),其中檢出19F最多,占29.4%(53),其次為：23F16.1%(29)、6型15%(27)19A11.7%(21),15B5.6%(10)、14型3.3%(4),15A、18C、9V、4各占0.6%(1),檢出兩種血清型混合感染占10%(18),未檢出相關(guān)血清型6.7%(12),新型多重?zé)晒馓结樂ㄅc金標(biāo)準(zhǔn)血清型特異性PCR+測序方法檢測結(jié)果無顯著性差異,一致性強(qiáng)(Kappa=0.845, P=0.000),與mPCR方法檢測結(jié)果無顯著性差異,一致性強(qiáng)(Kappa=0.863, P=0.000);新型多重?zé)晒馓结樂ê蚼PCR法檢測呼吸道SP菌株十種血清型的準(zhǔn)確性相同,敏感性97.6%、特異性100%、陽性預(yù)測值100%、陰性預(yù)測值75%。新型多重?zé)晒馓结樂z測呼吸道菌株單種血清型感染的敏感性、特異性均為100%,mPCR法的檢測敏感性、特異性為98.6%、100%。對(duì)22例具有兩種血清型混合感染菌株分析顯示,以6/19F混合感染最多(12),23F可與多種血清型混合感染(共4種),新型多重?zé)晒馓结樂ê蚼PCR方法對(duì)混合感染的菌株血清型檢測敏感性均為81.8%(18/22),特異性均為100%(158/158),陽性預(yù)測值均為100%(18/18),陰性預(yù)測值新型多重?zé)晒馓结樂�、mPCR法為97.6%(158/162)、98.8%(160/162)；新型多重?zé)晒馓结樂ㄅcmPCR方法檢測混合血清型的一致性好(Kappa=0.941, P=0.000),兩方法無顯著性差異(McNemar P=0.5);新型多重?zé)晒馓结樂ㄅc金標(biāo)準(zhǔn)法檢測混合血清型的一致性好(Kappa=0.888, P=0.000),兩方法無顯著性差異(McNemar P=0.125)。經(jīng)分別比較侵襲性和呼吸道SP菌株檢出血清型6、14、19F、23F、15B、19A的陽性率,血清型14在侵襲性菌株中的陽性率23.3%顯著高于呼吸道菌株中的陽性率3.3%,差異有顯著性(x2=14.435, v=1,P=0.001),其他血清型在兩種樣本中分布未見顯著性差異。不包括檢出混合血清型,三組mPCR方法每一組mPCR分別檢出侵襲性SP菌株血清型覆蓋率為36.7%、46.7%、16.7%,三組mPCR方法每一組mPCR分別可檢出呼吸道SP菌株血清型覆蓋率為39.4%、19.4%、21.1%。 4種檢測血清型方法中,本研究新型多重?zé)晒馓结樂ㄆ骄ㄙM(fèi)約10元／例,遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)方法167元／例,檢測十種血清型完成時(shí)間最快3小時(shí),遠(yuǎn)比測序法3天時(shí)間短,只需要一次PCR,采用熒光定量PCR儀直接觀察結(jié)果,無污染、高通量,操作最簡單。檢測臨床菌株的準(zhǔn)確性與mPCR法一致,整個(gè)體系穩(wěn)定,適用于臨床大量SP菌株的血清型初篩檢測。 第三章深圳市寶安區(qū)臨床SP菌株檢出血清型分布特點(diǎn)與疫苗覆蓋率 本研究采用血清型1/3/5/7F特異性PCR補(bǔ)充檢測第二章中的未知血清型菌株,對(duì)第二章中的臨床SP菌株檢出血清型進(jìn)行分布特點(diǎn)與疫苗覆蓋率的流行病學(xué)分析,結(jié)果顯示： 首先,侵襲性菌株和呼吸道菌株檢出血清型的PCV7/13疫苗覆蓋率較高,分別為86.7%/93.3%和74.4%/86.1%(細(xì)分兩種混合感染血清型結(jié)果后),不同樣本類型的疫苗覆蓋率之間沒有顯著性差異；呼吸道菌株檢出兩種混合感染血清型能被PCV7和PCV13覆蓋的比例相同,均為81.8%,兩種混合感染血清型分別表現(xiàn)為6+19F/6+23F/23F+19F,其余18.2%不能完全被PCV7或PCV13覆蓋,如排除兩種混合感染血清型結(jié)果,則侵襲性菌株的PCV7/13疫苗覆蓋率均顯著高于呼吸道菌株； 其次,侵襲性和呼吸道SP中非PCV7疫苗血清型分布特點(diǎn)：侵襲性SP中共計(jì)4例為非PCV7疫苗血清型(13.3%),其中有PCV13疫苗血清型19A2例與非PCV13疫苗血清型15B2例；呼吸道SP中共計(jì)46例為非PCV7疫苗血清型(25.6%),其中有PCV13疫苗血清型19A(43.5%)和5型(2.2%)共計(jì)45.7%；其他非PCV13疫苗血清型共計(jì)54.3%,其中與15B有關(guān)的可達(dá)26.1%(包括15B+23F2.2%,15B+19A2.2%,15B21.7%),與15A有關(guān)的占4.4%(15A+23F),與PCV7疫苗血清型23F有關(guān)的占6.7%(15A+23F4.4%,15B+23F2.2%)；與19A有關(guān)的共計(jì)45.7%(19A43.5%,15B+19A2.2%)；非PCV13未知型(除外15A/15B)23.9%。 因此,通過本研究方法對(duì)臨床菌株血清型的檢測,能基本闡述本地區(qū)菌株的血清型分布特點(diǎn),說明本研究方法對(duì)臨床菌株的血清型的檢測具有重要的流行病學(xué)分析的價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R725.6;R440

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2441037