【摘要】：背景與目的： 腸道病毒71型（EV71）是引起手足口病的主要病原體，多感染學(xué)齡前兒童，尤以3歲以下發(fā)病率最高。近年來，EV71的暴發(fā)和流行在亞太地區(qū)呈明顯上升趨勢，且引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。在世界大多數(shù)國家和地區(qū)基本消滅脊髓灰質(zhì)炎病毒之后，EV71被認(rèn)為是臨床最重要的嗜神經(jīng)性病毒，嚴(yán)重危害兒童的身體健康。目前臨床治療EV71感染主要是減輕癥狀，尋求安全、特異、有效的藥物治療手段已經(jīng)成為世界范圍關(guān)注的熱點。 RNA干擾（RNAi）是雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。由于RNAi具有特異性、高效性等特點，它已被成功應(yīng)用于抗病毒感染研究。分子流行病學(xué)分析表明，EV71中國流行株在近10余年內(nèi)沒有發(fā)生很大的基因多態(tài)性改變，所以尋求RNAi的有效靶點、通過效應(yīng)分子小干擾RNA（siRNA）抑制多株EV71中國流行株成為可能。既往研究表明，靶向EV71基因組3’UTR、VP1、3D、2C、3C區(qū)域的siRNAs能夠有效抑制EV71感染，而針對EV71基因組高度保守的5’非編碼區(qū)（UTR）的特異、有效siRNAs尚未見到報道。EV71基因組5’UTR高度保守，其在病毒RNA的合成以及病毒蛋白的翻譯過程中發(fā)揮重要作用，以此為靶點篩選有效siRNAs將可能具有廣譜抗EV71效能。近年來，siRNAs的化學(xué)修飾研究取得了很大的進(jìn)步，對篩選的有效siRNAs進(jìn)行合適的化學(xué)修飾可以優(yōu)化siRNA的特性，極大推動siRNA進(jìn)入臨床的可能性。 本研究旨在篩選靶向EV71基因組高度保守的5’UTR的有效siRNAs，確定有效靶點序列，并通過化學(xué)修飾優(yōu)化siRNAs的特性，檢測它們針對EV71中國流行株是否具有廣譜抗病毒效能，并研究靶向5’UTR的化學(xué)修飾siRNAs對乳鼠EV71感染的抑制作用，為RNAi治療EV71走向臨床提供一定的實驗基礎(chǔ)。 方法： 1.采用多特征融合的方法，設(shè)計靶向EV71基因組5’UTR的siRNAs。 2.通過細(xì)胞毒性實驗檢測siRNAs對RD細(xì)胞生存和生長的影響。 3.通過細(xì)胞生存實驗、實時TaqMan RT-PCR實驗篩選有效的siRNAs，確定有效靶點序列。 4.針對篩選出的兩個有效siRNAs的雙鏈RNA的UC序列分別進(jìn)行2’-OMe修飾及2’-F修飾，得到6個未修飾及化學(xué)修飾siRNAs（si-1、si-1OMe、si-1F、si-2、si-2OMe、si-2F）。 5.通過激光共聚焦及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測siRNA轉(zhuǎn)染情況。 6.從細(xì)胞毒性、RNAi活性、免疫刺激反應(yīng)、血清穩(wěn)定性四個方面，對靶向5’UTR的未修飾siRNAs與相應(yīng)的化學(xué)修飾siRNAs進(jìn)行比較。 7.將Genbank中近5年來發(fā)布的具有全基因序列的108株EV71中國流行株進(jìn)行比對，分析siRNAs對應(yīng)序列的同源性。 8.針對核苷酸序列分析結(jié)果，采用另一株中國流行株EU703812進(jìn)行實驗（此病毒株基因組特點是在115-133核苷酸序列與si-1對應(yīng)序列完全匹配，而在648-666核苷酸序列與si-2對應(yīng)序列有一個核苷酸錯配，此相同且單一核苷酸錯配在近5年來發(fā)布的具有全基因序列的108株中國流行株中達(dá)41.66%），，比較siRNAs對兩株不同EV71中國流行株感染的抑制作用。 9.將si-2改變一個核苷酸使之完全與病毒株EU703812對應(yīng)，并進(jìn)行修飾，評估未修飾及化學(xué)修飾siRNAs對病毒株EU703812的抑制作用。 10.通過EV71感染乳鼠的實驗研究，建立EV71感染乳鼠模型。 11.通過乳鼠癥狀、體重、生存率等指標(biāo)評價化學(xué)修飾siRNAs對乳鼠的毒性。 12.通過觀察感染乳鼠的癥狀、體重、生存率，實時熒光定量RT-PCR檢測感染乳鼠小腸組織中EV71RNA轉(zhuǎn)錄水平，組織切片HE染色觀察感染乳鼠小腸組織病變及免疫組化檢測感染乳鼠腸上皮細(xì)胞中EV71特異性VP1蛋白表達(dá)，初步探討靶向5’UTR的化學(xué)修飾siRNAs對乳鼠EV71感染的抑制作用。 結(jié)果： 1.篩選出靶向EV71基因組高度保守的5’UTR的有效siRNAs （1）初步篩選出滿足設(shè)計條件的靶向EV71基因組5’UTR的si-1、si-2、si-3、si-4、si-55個siRNAs。 （2）所篩選出的siRNAs均未影響RD細(xì)胞生存及生長，對培養(yǎng)細(xì)胞無明顯毒性。 （3）靶向EV71基因組5’UTR的si-1、si-2能夠明顯提高感染細(xì)胞的生存率、降低感染細(xì)胞中EV71RNA的轉(zhuǎn)錄水平，且這種抗病毒效能具有序列特異性。 2.靶向5’UTR的未修飾及化學(xué)修飾siRNAs對EV71感染的體外抑制作用 （1）SiRNA轉(zhuǎn)染6h后，激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)帶有熒光素標(biāo)記的si-2FAM在RD細(xì)胞漿中清晰可見，隨著si-2FAM濃度的升高，RD細(xì)胞中si-2FAM含量明顯增加；進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀精確檢測轉(zhuǎn)染效率，在25nM、50nM、100nM的濃度下，si-2FAM的轉(zhuǎn)染效率分別為79.47±1.79%、87.73±2.67%、97.17±0.86%。因此，50nM、100nM已足夠進(jìn)行下一步RNAi實驗。 （2）無論是未修飾的還是化學(xué)修飾的21nt siRNAs均未影響RD細(xì)胞生存及生長，對培養(yǎng)細(xì)胞無明顯毒性。 （3）與相應(yīng)的未修飾siRNAs相比，化學(xué)修飾的si-1F、si-2OMe、si-2F顯現(xiàn)出相似的的RNAi的活性，能夠延緩及減輕EV71感染致CPE、明顯提高EV71感染細(xì)胞的生存率、明顯降低感染細(xì)胞中EV71RNA的轉(zhuǎn)錄水平、明顯降低感染細(xì)胞中EV71特異性VP1蛋白的表達(dá)、明顯降低EV71病毒滴度；靶向EV71基因組5’UTR648-666核苷酸序列的化學(xué)修飾的si-2OMe、si-2F抗病毒效能優(yōu)于靶向EV71基因組5’UTR115-133核苷酸序列的si-1F；化學(xué)修飾的si-1OMe抗病毒效能明顯降低。 （4）轉(zhuǎn)染未修飾及化學(xué)修飾siRNAs的細(xì)胞中均未出現(xiàn)PKR的升高，siRNAs作用的機制是由于特異性RNAi而非PKR的活化及干擾素反應(yīng)。 （5）未修飾的si-2在10%FBS、100%鼠血清及100%人血清中孵育6h后均不能檢測出，而化學(xué)修飾的si-2OMe、si-2F在同樣的條件下至少能檢測到48h。 3. SiRNAs對EV71中國流行株感染的抑制效能 （1）通過核苷酸序列分析表明，靶向EV71基因組5’UTR115-133核苷酸序列的siRNAs對應(yīng)序列的同源性達(dá)71.30%，靶向EV71基因組5’UTR648-666核苷酸序列的siRNAs對應(yīng)序列的完全同源性達(dá)37.04%，相同且單一核苷酸不同的達(dá)41.66%。 （2）SiRNAs對兩株EV71中國流行株感染的抑制作用比較表明：si-1、si-2均可提高感染兩株病毒的RD細(xì)胞生存率、降低細(xì)胞中EV71RNA的轉(zhuǎn)錄水平；si-1對兩株病毒株同樣有效，si-2對EU703812病毒株的效能低于HM003207病毒株，但仍能明顯提高感染EU703812病毒株的RD細(xì)胞生存率、降低細(xì)胞中EV71RNA的轉(zhuǎn)錄水平。 （3）改變一個核苷酸的siRNAs對病毒株EU703812的抑制作用研究表明，未修飾及化學(xué)修飾siRNAs均可以顯著提高感染EU703812病毒株的RD細(xì)胞生存率、降低細(xì)胞中EV71RNA的轉(zhuǎn)錄水平、減少細(xì)胞中EV71特異性VP1蛋白的表達(dá)。 4.靶向5'UTR的化學(xué)修飾siRNAs對乳鼠EV71感染的抑制作用 （1）建立了EV71感染1日齡ICR乳鼠模型。感染EV71的乳鼠可出現(xiàn)精神不振、活動減少等癥狀，在感染6～7天后上述癥狀消失。死亡時間多發(fā)生在病毒感染后24～96h，死亡率為30.0%。感染乳鼠體重增長相對緩慢，6～7天時與正常乳鼠差異最大，之后存活的感染乳鼠與正常乳鼠體重差距縮小。EV71感染第3天、5天，乳鼠小腸、肺、骨骼肌均可檢測出病毒RNA，7天骨骼肌不能檢測出病毒RNA，小腸、肺組織中含量也比較低，第14天各種組織均不能檢測出病毒RNA。感染第5天乳鼠小腸組織病變明顯，腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性。 （2）化學(xué)修飾siRNAs對乳鼠毒性研究表明，直至14天，轉(zhuǎn)染si-2A-OMe或si-2A-F的乳鼠精神、活動均無明顯變化，未出現(xiàn)死亡，體重增長未發(fā)生變化。 （3）通過RNAi乳鼠體內(nèi)實驗研究表明，靶向5’UTR的化學(xué)修飾siRNAs改善了乳鼠的感染癥狀，提高了EV71感染乳鼠的生存率，明顯降低了感染乳鼠小腸組織中EV71RNA的轉(zhuǎn)錄水平，減輕了小腸組織病變，降低了腸上皮細(xì)胞中EV71特異性VP1蛋白表達(dá)。 結(jié)論： 本研究篩選出靶向EV71基因組高度保守的5’UTR的兩個有效siRNAs，確定了EV71基因組5’UTR115-133核苷酸序列與648-666核苷酸序列兩個新的有效靶點。首次研究化學(xué)修飾siRNAs對EV71感染的抑制作用，獲得生物利用度高、穩(wěn)定性強的有效化學(xué)修飾siRNAs。通過核苷酸序列分析及不同的EV71中國流行株驗證，發(fā)現(xiàn)靶向EV71基因組5’UTR115-133核苷酸序列與648-666核苷酸序列的有效siRNAs可能對多株EV71中國流行株具有廣譜抗病毒效能。針對EV71基因組5’UTR648-666靶點的siRNAs具有更高的抗病毒效能�？舍槍V71基因組5’UTR115-133、648-666靶點序列設(shè)計siRNAs混合物（包括考慮單一核苷酸的錯配在同一位點設(shè)計一對siRNAs），對多株EV71中國流行株可能具有更廣譜的抗病毒效能。此外，通過乳鼠體內(nèi)試驗進(jìn)一步證實化學(xué)修飾的si-2A-OMe、si-2A-F對乳鼠無明顯毒性作用，并且能夠有效抑制乳鼠EV71感染。本研究為EV71的基因治療藥物的研究奠定了基礎(chǔ)，為siRNA抗EV71感染最終走向臨床提供了實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R725.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李晶華;方小楠;;腸道病毒71型研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報;2011年03期

2 張海濤;李鄭武;王瑩;張秀芹;郭長虹;李會成;;RNA干擾技術(shù)給藥途徑的研究進(jìn)展[J];重慶醫(yī)學(xué);2011年05期

3 李靜;戴瑩;雷亞克;霍細(xì)香;;人類腸道病毒71型研究進(jìn)展[J];公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué);2012年01期

4 畢煌壘;何軍林;劉克良;;小分子干擾RNA分子化學(xué)修飾研究進(jìn)展[J];國際藥學(xué)研究雜志;2008年06期

5 劉娟;李康;楊靜;王升啟;;腸道病毒71型(EV71)ICR乳鼠動物模型的建立[J];軍事醫(yī)學(xué);2011年11期

6 聶曉晶;張國成;李思袖;李亞絨;許東亮;孫新;張學(xué)紅;李小青;;西安地區(qū)EV71感染手足口病的臨床特征[J];臨床兒科雜志;2010年06期

7 劉穎悅;張國成;許東亮;豆玉鳳;黃娜;楊曉蕾;;西安地區(qū)手足口病患兒咽拭子中EV71的檢測及分離鑒定[J];臨床兒科雜志;2010年11期

8 楊兵;陳維賢;張莉萍;;siRNA化學(xué)修飾及靶向轉(zhuǎn)運策略的研究進(jìn)展[J];中國生物制品學(xué)雜志;2010年05期

9 黃堅;王晶晶;劉龍丁;;腸道病毒71型相關(guān)動物模型實驗的研究進(jìn)展[J];中國生物制品學(xué)雜志;2012年03期

10 武文斌;;siRNA核糖分子化學(xué)修飾對RNAi功能的影響[J];生物技術(shù)通報;2009年06期

本文編號：2439980