【摘要】：背景：腸道病毒71型(EV71)是引起兒童手足口病的主要病原體之一,其感染可引發(fā)腦炎、無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥,其中基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變而出現(xiàn)的肺水腫、肺出血是導(dǎo)致少數(shù)患兒死亡的主要原因。目前人們對(duì)EV71引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)病變的發(fā)病機(jī)制尚不明確,本研究探討了EV71感染患兒血漿、腦脊液中細(xì)胞因子表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系,分析了感染急性期和恢復(fù)期(甲潑尼龍、丙種球蛋白聯(lián)合治療7-14天后)腦脊液細(xì)胞因子的表達(dá)變化；同時(shí)通過(guò)比較腦脊液細(xì)胞因子的表達(dá)差異,評(píng)價(jià)了糖皮質(zhì)激素和免疫球蛋白在EV71感染引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中的治療作用。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：2010年4月到2011年9月,采集南京市兒童醫(yī)院手足口病住院患兒血漿、腦脊液標(biāo)本,通過(guò)PCR擴(kuò)增方法確定感染病毒的類型；同期采集5歲以下健康體檢兒童血樣14例作為正常對(duì)照。本研究共檢測(cè)確診EV71感染的手足口病患兒血漿標(biāo)本62例,其中普通型18例；重癥33例；危重癥11例(其中死亡5例)。腦脊液標(biāo)本118例,其中手足口病并發(fā)腦炎、腦膜炎36例(急性期恢復(fù)期各18例)；并發(fā)脊髓炎20例(急性期恢復(fù)期各10例)；并發(fā)腦干腦炎28例(急性期恢復(fù)期各14例)；并發(fā)神經(jīng)性肺水腫6例(僅急性期,其中死亡2例)。EV71型腦炎經(jīng)糖皮質(zhì)激素(甲潑尼龍)治療48h患兒腦脊液樣本12例,EV71型腦炎經(jīng)丙種單球蛋白治療48h患兒腦脊液樣本16例。采用流式液相多重蛋白定量技術(shù)(Cytometric Beads Array-CBA)檢測(cè)血漿、腦脊液細(xì)胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-10,IFN-a,IFN-y,IP-10,IL-8,RANTES,MCP-1,MIG等)表達(dá)變化。 結(jié)果：EV71感染的重癥、危重癥患兒血漿中IL-1p,IL-6的濃度顯著高于正常對(duì)照組；危重癥患兒血漿IL-6和IL-8的濃度顯著高于重癥病例組和普通型手足口病。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)分析,EV71感染引發(fā)的腦炎、腦干腦炎和脊髓炎各組,腦脊液IL-6,IP-10,IL-8,MIG和(或)IL-1β的表達(dá),恢復(fù)期較急性期顯著下降；EV71感染的神經(jīng)性肺水腫或腦干腦炎患兒急性期腦脊液IL-6,IL-8,IFN-y和(或)IL-1p,IP-10的表達(dá)顯著高于普通腦炎患兒和脊髓炎患兒。另外,患兒血漿、腦脊液中TNF-α,IL-10,IFN-α,RANTES,MCP-1的濃度,在各組間均無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)差異。經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療48h后,腦炎患兒腦脊液IP-10、IL-8的濃度較腦炎急性期和免疫球蛋白治療組顯著降低；IL-6的濃度較腦炎急性期和免疫球蛋白治療組有降低趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EV71感染腦炎患兒經(jīng)免疫球蛋白治療48h后,腦脊液細(xì)胞因子的表達(dá)與腦炎急性期相比,無(wú)明顯差別。 結(jié)論：中樞神經(jīng)系統(tǒng)是EV71感染引起炎癥反應(yīng)的主要部位,腦脊液細(xì)胞因子的表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān),通過(guò)對(duì)腦脊液IL-1β,IL-6,IL-8,IFN-γ等的檢測(cè),可以預(yù)測(cè)疾病的發(fā)展進(jìn)程。EV71感染患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)持續(xù)加重,可導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),從而引發(fā)危重癥的出現(xiàn)。檢測(cè)血漿中IL-6,IL-8的濃度水平,能對(duì)EV71感染的神經(jīng)性肺水腫等危重癥的出現(xiàn)起很好預(yù)警作用。糖皮質(zhì)激素可能通過(guò)抑制IP10等炎癥因子的表達(dá),對(duì)并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的EV71感染治療有效。 背景：模式識(shí)別受體(PRRs)能通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)誘導(dǎo)非特異性免疫應(yīng)答。Toll樣受體(TLRs)、RIG-I樣受體(RLRs)和NOD樣受體(NLRs)是目前發(fā)現(xiàn)的PPRs的三個(gè)主要家族。在病毒感染時(shí),他們通過(guò)識(shí)別病毒的RNA或DNA結(jié)構(gòu),激活細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素、前炎癥因子和趨化因子等對(duì)抗病毒感染。在并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的EV71感染過(guò)程中,患兒血漿、腦脊液樣本中均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的顯著增高,然而對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的信號(hào)機(jī)制尚不明確。本研究調(diào)查了EV71感染患兒血液?jiǎn)魏思?xì)胞TLRs、RLRs和NLRs等受體的基因表達(dá)情況,為研究EV71感染引起細(xì)胞因子增高的信號(hào)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：采集EV71感染的手足口病及健康兒童外周血液樣本,并分選出外周血單核細(xì)胞(PBMC),共檢測(cè)標(biāo)本77例,包括正常對(duì)照組14例；手足口病普通型18例；重癥型34例；危重癥型11例。采用Real-time PCR方法,檢測(cè)外周血單核細(xì)胞TLRs、RLRs和NLRs等受體mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：EV71感染的手足口病患兒(包括手足口病普通病例、重癥病例和危重癥病例)外周血單核細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR7、TLR8和Mda-5等受體1nRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高,而感染各組之間差異不明顯。EV71感染的重癥、危重癥病例,外周血單核細(xì)胞TLR3和RIG-Ⅰ受體mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低。此外,少數(shù)危重癥患兒外周血單核細(xì)胞NLRP3受體mRNA的表達(dá)增高,但是危重癥與其他各組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。EV71感染各組與正常對(duì)照組相比,TLR1、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10、NLRX1、NLRC5和NLRP1等模式識(shí)別受體的基因變化無(wú)明顯差異。 結(jié)論：EV71感染后,能激活TLR2等多種模式識(shí)別受體,并可能參與了病毒感染引發(fā)的細(xì)胞因子高表達(dá),及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),但是這些受體的基因表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度關(guān)系不大。EV71病毒能抑制TLR3,RIG-I等受體的基因轉(zhuǎn)錄,其詳細(xì)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。 背景：感染患兒血漿、腦脊液中前炎癥因子和趨化因子的表達(dá)水平,與疾病的臨床嚴(yán)重程度密切相關(guān),被認(rèn)為是病情發(fā)展進(jìn)程的良好預(yù)警指標(biāo),然而人們對(duì)細(xì)胞因子的細(xì)胞來(lái)源和信號(hào)機(jī)制尚不明確。本研究采用EV71病毒感染人類原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞,分析了病毒感染、復(fù)制情況及巨噬細(xì)胞的功能變化,并探討了其可能的信號(hào)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：體外分選培養(yǎng)人單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞,并用EV71病毒進(jìn)行感染,應(yīng)用免疫熒光、western blot、Real-time RT-PCR等技術(shù),分析病毒在巨噬細(xì)胞的感染復(fù)制情況。采用CBA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子(IL-1p,IL-6,TNF-α,IFN-α,IFN-γ,IP-10,IL-8,RANTES,MCP-1,MIG等)的表達(dá)情況,采用Real-time RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞中TLRs、RIG-I和MDA5的基因表達(dá)變化。 結(jié)果：病毒能有效的感染人原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞,并且能在巨噬細(xì)胞中復(fù)制和翻譯蛋白。EV71病毒而不是UV滅活病毒在早期(12-h POI.)就能顯著刺激細(xì)胞分泌TNF-α,但是培養(yǎng)上清中TNF-a的表達(dá)水平隨時(shí)間而逐漸降低。EV71病毒能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6,但不能誘導(dǎo)IFN-α和IFN-γ的產(chǎn)生。不僅有活性的EV71病毒能刺激趨化因子IL-8, RANTES和IP-10的高表達(dá),UV滅活病毒也能有效的刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-8。此外,EV71能激活巨噬細(xì)胞TLR2,TLR7和TLR8mRNA的表達(dá)活化,對(duì)其他模式識(shí)別受體的基因表達(dá)影響不大。 結(jié)論：本研究首次證實(shí)了EV71能感染人類原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞,并且能在巨噬細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。巨噬細(xì)胞不僅是EV71攻擊的靶細(xì)胞,也是重要的效應(yīng)細(xì)胞,在EV71病毒的刺激下,巨噬細(xì)胞能分泌大量細(xì)胞因子對(duì)抗病毒感染。然而巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化,可能會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)和病毒的擴(kuò)散,從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。我們研究結(jié)果提示,巨噬細(xì)胞可能在EV71感染引發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R725.1

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本文編號(hào)：2430881