【摘要】：目的本研究通過(guò)觀察過(guò)敏性紫癜(HSP)患兒血清a Ig A1和胞外酸刺激對(duì)體外培養(yǎng)的人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMECs)中酸敏感離子通道(ASICs)表達(dá)的影響,及其對(duì)炎癥因子分泌和細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)的影響,并且觀察酸敏感離子通道阻斷劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,探討ASICs在HSP患兒血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷中的調(diào)控作用。方法1.樣本采集及聚合Ig A1(a Ig A1)的分離及純化選取本院2015年1月至2015年6月初發(fā)急性期HSP患兒10例,另外選取10名健康體檢兒童作為正常對(duì)照組。抽取所有受試者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下5ml外周靜脈血,離心分離血清,用Jacalin親和層析法及蛋白純化法提取血清a Ig A1。2.實(shí)驗(yàn)分組將分化成熟的HDMECs消化后培養(yǎng)于六孔板中。預(yù)實(shí)驗(yàn)中,將六孔板細(xì)胞分為四組:1組為p H6.0組;2組為p H6.5組;3組為p H7.0組;4組為p H7.4組,每組三孔,將Hepes液依次加入1、2、3、4組,調(diào)整培養(yǎng)液p H值分別為6.0、6.5、7.0、7.4,培養(yǎng)4h。另外將六孔板細(xì)胞分為十組:1組為空白對(duì)照組;2組為p H6.5組;3組為正常Ig Al組;4組為正常Ig Al+p H6.5組;5組為正常Ig Al+p H6.5+阿米洛利組;6組為正常Ig Al+p H6.5+Pc TX1組;7組為HSP Ig Al組;8組為HSP Ig Al+p H6.5組;9組為HSP Ig Al+p H6.5+阿米洛利組;10組為HSP Ig Al+p H6.5+Pc TX1組,每組3個(gè)孔;將健康兒童或HSP患者血清的a Ig A1加入六孔板中,3-6組加健康兒童a Ig Al,7-10加HSP患者a Ig A1,并調(diào)整培養(yǎng)基中a Ig A1最終濃度250μg/ml,培養(yǎng)6h后棄去上清液;5組、9組加入阿米洛利100μmol/L,6組、10組加入Pc TX1 20nmol/L,0.5h后,將Hepes液依次加入2、4、5、6、8、9、10組,調(diào)整培養(yǎng)基p H值為6.5,培養(yǎng)4h。3.IL-8、NO和TM的濃度測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-8、NO和TM水平。4.分析ASICs、destrin和SM-αm RNA和蛋白的表達(dá)分別采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(q PCR)和蛋白免疫印跡法(WB)分析實(shí)驗(yàn)組ASIC1a、ASIC2a、ASIC3、destrin and和SM-αm RNA和蛋白的表達(dá)情況和預(yù)實(shí)驗(yàn)組ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 m RNA表達(dá)情況。結(jié)果1、預(yù)實(shí)驗(yàn)中,p H6.5組HDMECs中的ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 m RNA表達(dá)量較其他三組明顯增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05);2、細(xì)胞外酸化和HSP患兒血清a Ig A1能誘導(dǎo)HDMECs中酸敏感離子通道(ASIC1a、ASIC2a、ASIC3)表達(dá)上調(diào),p H6.5組和HSP Ig Al組較空白對(duì)照組及正常Ig Al組ASICs表達(dá)量多,且HSP Ig Al+p H6.5組較HSP Ig Al組ASICs表達(dá)量多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05);3、細(xì)胞外酸化和HSP患兒血清a Ig A1能刺激HDMECs中IL-8、TM及NO釋放,p H6.5組和HSP Ig Al組均較空白對(duì)照組及正常Ig Al組IL-8、TM及NO釋放量明顯增多,且HSP Ig Al+p H6.5組較HSP Ig Al組IL-8、TM及NO釋放量明顯增多,阿米洛利和Pc TX1能夠抑制炎癥因子的過(guò)多釋放,HSP Ig Al+p H6.5+阿米洛利組和HSP Ig Al+p H6.5+Pc TX1組較HSP Ig Al+p H6.5組IL-8、TM及NO釋放量減少。此外,在HSP Ig Al+p H6.5組中,IL-8、TM、NO水平分別與ASIC1a m RNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.947,0.864,0.829);IL-8、TM、NO水平分別與ASIC2a m RNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.833,0.827,0.874);IL-8、TM、NO水平分別與ASIC3 m RNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.777,0.851,0.693),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05);4、細(xì)胞外酸化和HSP患兒血清a Ig A1能減少HDMECs中細(xì)胞骨架蛋白(destrin、SM-α)的表達(dá),p H6.5組和HSP Ig Al組均較空白對(duì)照組及正常Ig Al組destrin、SM-α表達(dá)量明顯減少,且HSP Ig Al+p H6.5組較HSP Ig Al組destrin、SM-α表達(dá)量明顯減少,阿米洛利和Pc TX1能夠抑制destrin、SM-α的表達(dá)減少,HSP Ig Al+p H6.5+阿米洛利組和HSP Ig Al+p H6.5+Pc TX1組較HSP Ig Al+p H6.5組destrin、SM-α表達(dá)量多,此外,在HSP Ig Al+p H6.5組中,destrin和SM-αm RNA的表達(dá)水平與ASIC1a m RNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(R=-0.713,-0.867),destrin和SM-αm RNA的表達(dá)水平與ASIC2a m RNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(R=-0.842,-0.798),destrin和SM-αm RNA的表達(dá)水平與ASIC3 m RNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(R=-0.671,-0.742),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05);結(jié)論細(xì)胞外酸化和HSP患兒血清a Ig A1均能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HDMECs中酸敏感離子通道(ASICs)的表達(dá)上調(diào),引起炎癥因子的大量釋放及細(xì)胞骨架蛋白下調(diào),造成內(nèi)皮細(xì)胞受損;其中,胞外酸化作用更強(qiáng)。而ASICs阻斷劑能抑制這些效應(yīng),對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用,從反面也證明了ASICs可能參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷過(guò)程。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R725.5
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本文編號(hào)：2397249