發(fā)布時(shí)間：2018-12-14 11:45

【摘要】：第一部分甲基化寡核苷酸誘導(dǎo)滅活小鼠胚胎干細(xì)胞EDNRB基因 目的：先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung's disease, HD)是新生兒最常見(jiàn)的腸道畸形之發(fā)病因素包括遺傳因素和環(huán)境因素。EDNRB/EDN3/ECE1信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常是HD重要發(fā)病機(jī)制,但該信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因突變不能解釋全部HD患者病因,HD中EDNRB基因突變率僅3%左右。本研究旨在設(shè)計(jì)合成特異性甲基化寡核苷酸誘導(dǎo)滅活EDNRB基因,探討EDNRB基因甲基化與HD發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。 方法：在Genbank和DBTSS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索小鼠EDNRB基因序列及啟動(dòng)子序列,根據(jù)甲基化寡核苷酸設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)與EDNRB基因啟動(dòng)子互補(bǔ)甲基化寡核苷酸,在5’端標(biāo)記FITC,采用Effectine將寡核苷酸轉(zhuǎn)染至C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞,采用流式細(xì)胞分選儀分選FITC陽(yáng)性細(xì)胞,并將1μM 5-Aza-dC處理轉(zhuǎn)染后C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞,采用重亞硫酸鹽測(cè)序法(BSP)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后及5-Aza-dC處理后C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞EDNRB基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)改變。 結(jié)果：C57BL/6小鼠EDNRB基因啟動(dòng)子1008～2889bp為CpG島：A%：23.22,T%：23.65,C%：25.13,G%：28.00,C+G%：53.13,CpG%：4.20,A+T/C+G%：0.88。采用Effectine轉(zhuǎn)染寡核苷酸至C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞效率為40.2%。MON1與BSP擴(kuò)增產(chǎn)物第3、4、5CG位點(diǎn)對(duì)應(yīng)；MON1轉(zhuǎn)染前,C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞EDNRB基因啟動(dòng)子1～16CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%；轉(zhuǎn)染MON1后BSP測(cè)序示1～2CG位點(diǎn)和6～16CG位點(diǎn)甲基化率分別為30%、40%、50%、40%、40%、40%、40%、40%、40%、30%、20%、20%和10%,MON1對(duì)應(yīng)的BSP擴(kuò)增產(chǎn)物3、4、5CG位點(diǎn)甲基化率分別為60%、60%和60%；5-Aza-dC處理后,C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞EDNRB基因啟動(dòng)子1～16CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%。MON2對(duì)應(yīng)BSP擴(kuò)增產(chǎn)物9、10、11CG位點(diǎn)；MON2轉(zhuǎn)染前,EDNRB基因1～16CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%；轉(zhuǎn)染后1～8CG位點(diǎn)和12～16CG位點(diǎn)甲基化率分別為20%、30%、40%、40%、50%、40%、50%、60%、70%、60%、40%、40%和30%,MON2對(duì)應(yīng)9、10、11CG位點(diǎn)甲基化率為70%；5-Aza-dC處理后,C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞EDNRB基因啟動(dòng)子1～16CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%。MON3對(duì)應(yīng)BSP擴(kuò)增產(chǎn)物13、14、15CG位點(diǎn),轉(zhuǎn)染前,互補(bǔ)EDNRB基因啟動(dòng)子1～20CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%；轉(zhuǎn)染后1～12CG位點(diǎn)、16～20CG甲基化率分別為10%、10%、30%、30%、30%、40%、50%、50%、50%、60%、60%、60%、60%、60%、50%、30%和10%,MON3對(duì)應(yīng)13、14、15CG位點(diǎn)甲基化率為70%；5-Aza-dC處理后,C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞EDNRB基因啟動(dòng)子1～20CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%。MON4對(duì)應(yīng)BSP擴(kuò)增產(chǎn)物第2、3、4、5CG位點(diǎn)；轉(zhuǎn)染前對(duì)應(yīng)EDNRB基因1～8CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%；轉(zhuǎn)染后,第1CG位點(diǎn)、MON4對(duì)應(yīng)2、3、4、5CG位點(diǎn)和6～8CG和甲基化率為分別為10%、20%、20%、20%、20%、10%、10%和0%；5-Aza-dC處理后,EDNRB基因啟動(dòng)子1～8CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%。CON1與MON2除mCG外堿基序列一致,CONl轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后及5-Aza-dC處理后C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞EDNRB基因啟動(dòng)子1～16CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%。CON2與MON2除首尾外堿基序列一致,CON2轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后及5-Aza-dC處理后EDNRB基因啟動(dòng)子1～16CG位點(diǎn)甲基化率均為0.0%。轉(zhuǎn)染前MON1、MON2, MON3、MON4、CON1和CON2 C57BL/6 mESC細(xì)胞EDNRB/GAPDH無(wú)明顯差異(均P0.05)；轉(zhuǎn)染后,MON1、MON2、MON3轉(zhuǎn)染的C57BL/6 mESC細(xì)胞EDNRB/GAPDH較轉(zhuǎn)染前顯著降低(均P0.05)；轉(zhuǎn)染MON4、CON1和CON2的C57BL/6 mESC細(xì)胞EDNRB/GAPDH較轉(zhuǎn)染前無(wú)明顯差異(均P0.05)；5-Aza-dC處理后,轉(zhuǎn)染MON1、MON2、MON3的細(xì)胞EDNRB/GAPDH較作用前顯著升高(均P0.05),處理后MON4、CON1和CON2細(xì)胞的EDNRB/GAPDH無(wú)明顯差異(均P0.05)。MON4、CON1和CON2轉(zhuǎn)染后EDNRB蛋白質(zhì)表達(dá)水平與正常未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)明顯差異(P0.05),甲基化寡核苷酸MON1、MON2和MON3轉(zhuǎn)染后C57BL6/J mESC細(xì)胞EDNRB蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著低于正常未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和寡核苷酸MON4、CON1及CON2轉(zhuǎn)染細(xì)胞(均P0.05)；轉(zhuǎn)染MON3甲基化寡核苷酸后C57BL6/J mESC細(xì)胞EDNRB蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著低轉(zhuǎn)染甲基化寡核苷酸MON1和MON2的C57BL6/J mESC細(xì)胞(均P0.05)；轉(zhuǎn)染甲基化寡核苷酸MON2后EDNRB蛋白質(zhì)表達(dá)水平低于轉(zhuǎn)染甲基化寡核苷酸MON1細(xì)胞,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5-Aza-dC作用后,轉(zhuǎn)染MON1、MON2、MON3、MON4、CON1和CON2的C57BL6/J mESC細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞EDNRB蛋白質(zhì)表達(dá)無(wú)明顯差異。 結(jié)論：特異互補(bǔ)甲基化寡核苷酸可誘導(dǎo)EDNRB基因啟動(dòng)子產(chǎn)生甲基化,其誘導(dǎo)產(chǎn)生甲基化及抑制基因表達(dá)能力與甲基化寡核苷酸靶向EDNRB基因啟動(dòng)子位置有關(guān)。 第二部分甲基化寡核苷酸誘導(dǎo)EDNRB基因啟動(dòng)子甲基化的遺傳 目的：甲基化作為表觀遺傳學(xué)最重要的調(diào)控機(jī)制,具有遺傳穩(wěn)定性特點(diǎn),可在代代間、細(xì)胞周期中穩(wěn)定遺傳。在細(xì)胞有絲分裂DNA半保留復(fù)制時(shí),甲基化雙鏈解鏈形成復(fù)制叉樣模板,作為半甲基化底物在DNMT1催化下CG變成mCG,這種半保留復(fù)制機(jī)制使甲基化在細(xì)胞分裂中得到有效遺傳。本研究設(shè)計(jì)特異性針對(duì)EDNRB基因啟動(dòng)子甲基化寡核苷酸誘導(dǎo)其產(chǎn)生甲基化,檢測(cè)不同培養(yǎng)代數(shù)時(shí)EDNRB基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),探討甲基化寡核苷酸誘導(dǎo)EDNRB基因啟動(dòng)子產(chǎn)生的甲基化的遺傳性。 方法：在Genbank和DBTSS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索小鼠EDNRB基因序列及啟動(dòng)子序列,根據(jù)甲基化寡核苷酸設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)與EDNRB基因啟動(dòng)子互補(bǔ)甲基化寡核苷酸,在5’端標(biāo)記FITC,采用Effectine將寡核苷酸轉(zhuǎn)染至C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞,采用流式細(xì)胞分選儀分選FITC陽(yáng)性細(xì)胞并連續(xù)培養(yǎng),采用重亞硫酸鹽測(cè)序法(BSP)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后及培養(yǎng)不同代數(shù)時(shí)C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞EDNRB基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)改變。 結(jié)果：MON1、MON2、MON3和MON4轉(zhuǎn)染后互補(bǔ)EDNRB基因啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)CG位點(diǎn)甲基化率分別由0%、0%、0%和0%增加到60%、70%、70%和20%,轉(zhuǎn)染CON1和CON2前及轉(zhuǎn)染后互補(bǔ)EDNRB基因啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)CG甲基化率均為0%；MON1、MON2、MON3和MON4互補(bǔ)EDNRB基因啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)CG位點(diǎn)甲基化率隨著培養(yǎng)代數(shù)增加而下降,MON1、MON2和MON3轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6代時(shí)互補(bǔ)EDNRB基因啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)CG位點(diǎn)甲基化率下降至0%；MON4轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)3代互補(bǔ)EDNRB基因啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)CG位點(diǎn)甲基化率下降至0%。MON1、MON2和MON3轉(zhuǎn)染后EDNRB基因(?)nRNA和蛋白質(zhì)顯著降低,MON4、CON1和CON2轉(zhuǎn)染后較轉(zhuǎn)染前無(wú)明顯改變；將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng),MON1、MON2、MON3和MON4甲基化寡核苷酸轉(zhuǎn)染的EDNRB基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)隨培養(yǎng)代數(shù)的增加而增加,MON1、MON2、MON3在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)6代時(shí)EDNRB基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加至轉(zhuǎn)染前水平；MON4在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)3代時(shí)EDNRB基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加至轉(zhuǎn)染前水平；CON1和CON2轉(zhuǎn)染前后EDNRB基因mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變。 結(jié)論：甲基化寡核苷酸誘導(dǎo)EDNRB基因啟動(dòng)子產(chǎn)生的甲基化不具有穩(wěn)定的遺傳性,隨著培養(yǎng)代數(shù)增加,EDNRB基因啟動(dòng)子甲基化逐漸消失,抑制的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸恢復(fù)。通過(guò)甲基化寡核苷酸誘導(dǎo)滅活EDNRB基因途徑無(wú)法建立先天性巨結(jié)腸模型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2378557