【摘要】：近年來先天性心臟病(先心病)發(fā)病率呈顯著上升趨勢,已成為我國出生缺陷的首位病種,外科矯治是根治先心病最主要的手段,但由于我國特殊的實(shí)際情況使得先心病的外科治療面臨許多亟待解決的問題。先心病外科治療的主要時(shí)間窗是出生后,雖然心臟在出生時(shí)已經(jīng)完成大體結(jié)構(gòu)的發(fā)育,但在功能上尚需經(jīng)歷出生后一定時(shí)間的生長方可達(dá)到成熟,對出生后心臟的發(fā)育特點(diǎn)和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究無疑是先天性心臟病外科干預(yù)研究的首要任務(wù)。雖然心臟在胚胎期的發(fā)育過程已經(jīng)得到廣泛的研究,但是對于出生后未成熟心肌經(jīng)歷怎樣的過程轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨募∫约罢{(diào)控這種轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵機(jī)制卻知之甚少。 溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一類內(nèi)源性生物活性脂類信號分子,屬于溶血磷脂(lysophospholipids)分子的重要成員,通過其特異性G蛋白耦聯(lián)受體發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。雖然LPA受體在哺乳動(dòng)物胚胎心臟中的表達(dá)早有報(bào)道,但LPA及其介導(dǎo)的信號通路在心臟發(fā)育過程中究竟發(fā)揮什么功能卻至今不明。本研究在課題組以往研究的基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步探索LPA信號在心血管系統(tǒng)中的作用,尤其是出生后心臟發(fā)育成熟中的角色,首先對目前已經(jīng)確認(rèn)的所有溶血磷脂受體(包括LPA的5種受體以及另一種溶血磷脂分子1磷酸鞘胺醇(S1P)的5種受體)從胚胎末期到成年期在大鼠心臟的表達(dá)變化進(jìn)行了分析,然后依據(jù)發(fā)育表達(dá)譜所提供的線索,對LPA在出生后心臟成熟過程中可能參與調(diào)控的生物學(xué)過程進(jìn)行了功能學(xué)探索。 研究內(nèi)容主要包括三部分： 第一部分溶血磷脂受體在大鼠心臟發(fā)育中變化——從胚胎末期到成年期 這部分研究主要通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot和組織免疫化學(xué)的方法對10種溶血磷脂受體(Lpar1-5和Slpr1-5)在大鼠心臟中從胚胎末期到成年期的表達(dá)變化進(jìn)行了分析,主要研究發(fā)現(xiàn)包括(1)Lpar1、Lpar3、Lpar4、S1pr1、S1pr2、S1pr3為大鼠心臟主要的溶血磷脂受體亞型；(2)Lpar1、Lpar3和Lpar4的表達(dá)在出生后心臟發(fā)育過程呈現(xiàn)明顯的發(fā)育變化,在出生后2-3周內(nèi)的表達(dá)顯著高于之后的表達(dá),提示可能與出生后心臟功能的成熟相關(guān)；(3)Lpar1和Lpar4在出生后1周表達(dá)明顯增加,之后迅速下降,提示可能與出生后早期由于心肌細(xì)胞增殖而表現(xiàn)的心臟快速生長有關(guān)：(4)Lpar3在出生后1天的主動(dòng)脈壁和冠狀血管壁呈現(xiàn)高表達(dá),提示LPA-Lpar3可能參與心臟血管的發(fā)育；(5)S1prl、Slpr2、Slpr3雖然在心臟高表達(dá),但在出生后心臟發(fā)育過程中其表達(dá)并沒有發(fā)生明顯變化,提示S1P信號對心臟功能具有重要調(diào)節(jié)作用但在發(fā)育過程中并不發(fā)生角色轉(zhuǎn)換。 第二部分溶血磷脂酸對未成熟心肌細(xì)胞的促增殖作用及其信號機(jī)制初探 這部分研究在第一部分研究基礎(chǔ)上探討LPA及其受體是否調(diào)節(jié)了出生后早期未成熟心肌細(xì)胞的增殖過程。利用免疫熒光標(biāo)記心肌細(xì)胞直接計(jì)數(shù)和細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67,我們首次發(fā)現(xiàn)LPA不僅對出生后早期仍有增殖能力的Pld心肌細(xì)胞具有促增殖作用,并且對已經(jīng)失去增殖能力的P4d心肌細(xì)胞同樣具有明顯的促增殖作用,并且均呈現(xiàn)劑量依賴和時(shí)間依賴關(guān)系。Lpar3受體特異性激動(dòng)劑OMPT對未成熟心肌細(xì)胞具有顯著的促增殖作用,而Lpar1/Lpar3的拮抗劑Ki16425則可以完全阻斷LPA的促增殖作用,同時(shí),Lpar1、Lpar3和Lpar4在心臟不同細(xì)胞的表達(dá)分布顯示Lpar3在心肌細(xì)胞的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于心臟成纖維細(xì)胞,而Lparl和Lpar4則恰好相反,提示Lpar3可能主要參與了心肌細(xì)胞的功能調(diào)節(jié),而Lparl和Lpar4則主要介導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng),由此,我們認(rèn)為LPA可能是通過Lpar3介導(dǎo)了其對未成熟心肌細(xì)胞的促增殖作用。另外,LPA及其受體信號的激活可使進(jìn)入S期的心肌細(xì)胞明顯增加,提示LPA信號可能通過影響心肌細(xì)胞周期的進(jìn)程發(fā)揮促增殖作用。 第三部分溶血磷脂酸對出生后心肌細(xì)胞收縮及興奮-收縮耦聯(lián)的影響 這部分研究仍然是以第一部分的研究結(jié)果為線索,力圖證明在心肌收縮功能尚未成熟時(shí),LPA可以通過促進(jìn)肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加參與心肌收縮興奮-收縮耦聯(lián)過程進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞的收縮。但是,通過本部分研究我們沒能證實(shí)最初的研究假設(shè),但仍然有以下重要的研究發(fā)現(xiàn)：(1)不同于研究假設(shè)的是,LPA對出生后14天大鼠心肌細(xì)胞的收縮和鈣瞬變均沒有顯著影響,但符合研究假設(shè)的是,LPA不影響出生后21天大鼠心肌細(xì)胞的收縮和鈣瞬變,表明LPA信號并不參與出生后14-21天大鼠心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)過程和心肌細(xì)胞收縮；(2)在大鼠出生后發(fā)育過程中,Lpar1、Lpar3和Lpar4在整體心臟表達(dá)下調(diào)的時(shí)間點(diǎn)與在心肌細(xì)胞的下調(diào)時(shí)間點(diǎn)并不一致,由整體心臟的出生后21天提前到心肌細(xì)胞的出生后14天,提示在出生后14天LPA受體對心肌細(xì)胞的發(fā)育調(diào)節(jié)功能可能即已減弱或消失;(3)大鼠心臟的左室射血分?jǐn)?shù)在出生后14天即保持穩(wěn)定,與成年心臟呈現(xiàn)相同的水平,表明大鼠心肌收縮功能可能在出生后14天已達(dá)到成熟。綜合此3點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn),我們認(rèn)為本研究的部分假設(shè)——當(dāng)心肌功能成熟時(shí),LPA所介導(dǎo)的鈣信號減弱甚至消失,不再參與成熟心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)和收縮過程——可能仍然是成立的。 總之,本研究探索了一種內(nèi)源性生物活性分子——LPA在出生后心臟發(fā)育成熟中變化及其對未成熟心肌細(xì)胞增殖和收縮的調(diào)控作用,發(fā)現(xiàn)了LPA信號對心血管系統(tǒng)的新的生物學(xué)調(diào)節(jié)功能,加深了對未成熟心肌生長調(diào)節(jié)的認(rèn)識,為先心病的外科治療提供了切實(shí)可行的輔助性治療干預(yù)靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R725.4

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本文編號：2372711