【摘要】：肺炎為小兒時(shí)期的常見病,多為支氣管肺炎,好發(fā)于冬春季節(jié)或氣候交替之際,是我國(guó)住院小兒死亡的第一原因,嚴(yán)重威脅兒童健康,被世界衛(wèi)生組織列為全球三種重要兒科疾病之一,我國(guó)衛(wèi)生部也將其列為重點(diǎn)防治的小兒四病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),肺炎占目前城市醫(yī)院兒科病區(qū)住院病例的25%-50%；而病毒性肺炎是小兒肺炎的常見類型,約占小兒肺炎總數(shù)的50%。在引起小兒病毒性肺炎的病原體中又以呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)為主,西醫(yī)治療小兒RSV肺炎缺乏有效的治療手段,而中醫(yī)藥在治療病毒感染性疾病方面有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。 導(dǎo)師汪受傳教授領(lǐng)銜的課題組完成的臨床研究表明,具有開肺化痰解毒活血功效的金欣口服液是治療小兒病毒性肺炎痰熱閉肺證的有效方劑。前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,金欣口服液有明顯抑制RSV的作用,主要通過抑制病毒的膜融合,其作用位點(diǎn)可能是病毒的F蛋白或其受體；可明顯減低RSV感染后Hep-2細(xì)胞病變程度,對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用；具有誘導(dǎo)單個(gè)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ的作用,增強(qiáng)機(jī)體抗病毒免疫功能。 Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是重要的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs),可以識(shí)別不同微生物的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecule pattem, PAMPs)。TLRs在RSV感染過程中發(fā)揮著重要的作用,是研究RSV感染的新的方向。導(dǎo)師汪受傳教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)承擔(dān)的國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“金欣口服液對(duì)RSV活化的TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制研究(81072840)”前期研究成果已表明金欣口服液能調(diào)控RSV感染活化誘導(dǎo)的TLR3、TLR4及下游信號(hào)分子的表達(dá)水平。 RSV是單股負(fù)鏈RNA病毒,粘附融合宿主細(xì)胞后釋放單鏈RNA,能被位于內(nèi)體膜上的TLR7特異性識(shí)別,通過一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑,引起下游細(xì)胞因子的大量分泌,引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。鑒于中醫(yī)藥作用的多靶點(diǎn)性,本實(shí)驗(yàn)從TLR7及其介導(dǎo)的信號(hào)通路入手,探討RSV感染時(shí)金欣口服液抗對(duì)TLR7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控,及與其它TLRs的相關(guān)性。 目的 研究金欣口服液對(duì)RSV誘導(dǎo)的TLR7信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控作用,探討其治療RSV肺炎的可能免疫學(xué)機(jī)制。 方法 體外實(shí)驗(yàn)：RSV感染體外培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞,采用金欣口服液含藥血清進(jìn)行干預(yù),24h后收集細(xì)胞,real-time PCR法測(cè)定TLR7及其信號(hào)通路關(guān)鍵分子MyD88、NF-κB、IRF7mRNA的表達(dá)變化；Western Blot技術(shù)檢測(cè)TLR7、 MyD88、NF-κB、IRF7蛋白表達(dá),激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)TLR7在RSV感染RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)及分布；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中TNF-α、IFN-α表達(dá)情況；并用TLR7siRNA干擾后檢測(cè)上述指標(biāo),觀察金欣口服液對(duì)RSV誘導(dǎo)的TLR7傳導(dǎo)通路影響及與其它TLRs信號(hào)通路的相關(guān)性。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,金欣口服液進(jìn)行干預(yù),并于首次滴鼻后72、144小時(shí),取小鼠肺組織,分別行病理組織切片評(píng)價(jià)肺部病變情況,real-time PCR法檢測(cè)肺組織中TLR7、MyD88、NF-κB、IRF7mRNA表達(dá)情況,Western Blot法檢測(cè)小鼠肺組織TLR7、MyD88、NF-κB、IRF7蛋白表達(dá)情況；取小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF), ELISA法檢測(cè)TNF-α、IFN-α表達(dá)情況。 結(jié)果 一、體外實(shí)驗(yàn) 1.TLR7siRNA轉(zhuǎn)染前 (1)RSV感染RAW264.7細(xì)胞24h后,TLR7、NF-κB、IRF7mRNA表達(dá)明顯升高(超過正常組2倍以上,與正常組比較,P0.01),對(duì)MyD88mRNA的表達(dá)能提高,但沒超過2倍：金欣口藥血清組能明顯降低TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)(P0.01),對(duì)IRF7mRNA的表達(dá)下調(diào)作用不明顯(P0.05)。 (2)RSV感染RAW264.7細(xì)胞24h后,TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)量較正常組明顯升高(P0.01),而IRF7的蛋白表達(dá)無明顯改變；金欣口服液含藥血清組TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)量較RSV感染組明顯降低(P0.01)；對(duì)IRF7的蛋白表達(dá)無調(diào)控作用。 (3)RSV感染RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α未能檢測(cè)到；TNF-α表達(dá)量明顯升高(與正常組比較,P0.01)。金欣口服液含藥血清顯著降低TNF-α表達(dá)(P0.01)。 2. TLR7siRNA轉(zhuǎn)染后 (1) TLR7siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后,TLR7mRNA的表達(dá)量下降46.6%,再用RSV感染,可見TLR7mRNA的表達(dá)又有明顯增高(超過TLR7siRNA轉(zhuǎn)染組的2倍以上),表明用篩選出的TLR7siRNA可干擾TLR7mRNA的生成。TLR7信號(hào)通路下游信號(hào)分子MyD88、NF-κB mRNA的表達(dá)也受到抑制,但其抑制率低于TLR7mRNA(分別為26.9%、27.3%),未成平行抑制關(guān)系,表明MyD88、NF-κB mRNA的表達(dá)可能還受其它因素的調(diào)控,特別是TLRs家族的其它成員。TLR7siRNA轉(zhuǎn)染后IRF7mRNA的表達(dá)未受明顯影響。 (2)金欣口藥血清能明顯降低轉(zhuǎn)染及RSV感染后的TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)(P0.01),對(duì)IRF7mRNA的表達(dá)下調(diào)作用不明顯(P0.05)。 (3)RSV感染RAW264.7細(xì)胞24h后,TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)量較正常組明顯升高(P0.01),而IRF7的蛋白表達(dá)無明顯改變；金欣口服液含藥血清組能明顯下調(diào)TLR7、NF-κB蛋白表達(dá)量(P0.01),但對(duì)MyD88的調(diào)控不明顯(P0.05)；對(duì)IRF7的蛋白表達(dá)無調(diào)控作用。 (4) TLR7siRNA轉(zhuǎn)染后繼以RSV感染RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α仍未能檢出；TNF-α表達(dá)量明顯升高(與正常組比較,P0.01),金欣口服液含藥血清顯著降低TNF-α表達(dá)(P0.01)。 二、體內(nèi)試驗(yàn) (1)RSV感染BALB/c小鼠后肺部病理改變主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)性病變,肺泡壁血管擴(kuò)張充血,水腫增厚,肺泡壁及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡腔無明顯滲出物；支氣管腔內(nèi)無顯著炎性滲出物,上皮細(xì)胞無顯著變性、壞死。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),肺部病變程度逐漸加重。金欣口服液組小鼠肺內(nèi)炎癥均有不同程度減輕,病理評(píng)分結(jié)果顯示治療組各時(shí)間點(diǎn)與RSV感染組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。 (2)RSV感染BALB/c小鼠72h后,肺組織中TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)顯著增高(與正常組比較,P0.01),而144h組隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),TLR7、 MyD88、NF-κB mRNA的表達(dá)則下降。金欣口服液組TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)較RSV感染組不同程度降低(P0.01或P0.05)。 RSV感染BALB/c小鼠72、144h后,肺組織中IRF7mRNA表達(dá)量與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),金欣口服液高劑量組在感染72h能下調(diào)IRF7mRNA表達(dá)(P0.05),金欣口服液高劑量組、等效劑量組在144h能上調(diào)IRF7mRNA表達(dá),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 (3)RSV感染BALB/c小鼠72h后肺組織內(nèi)TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)量較正常組高(P0.01或P0.05),144h表達(dá)下降與正常組無明顯差異。金欣口服液組TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)量于72h較RSV感染組不同程度降低(P0.01或P0.05),感染144h金欣口服液組TLR7、MyD88、NF-κB表達(dá)量下降較RSV組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 RSV感染BALB/c小鼠72h后肺組織內(nèi)IRF7蛋白表達(dá)量較正常組無顯著差異(P0.05),144h表達(dá)較正常有所上升(P0.05)。金欣口服液組IRF7蛋白表達(dá)量于72h較RSV感染組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,感染144h金欣口服液組能上調(diào)IRF7蛋白表達(dá)(P0.01)。 (4)RSV感染BALB/c小鼠72h后,BALF中TNF-α、IFN-α表達(dá)量均明顯升高(與正常組比較,P0.01);144h, BALF中TNF-α、IFN-α下降。72h,金欣口服液組小鼠BALF中TNF-α、IFN-α表達(dá)較感染組顯著上升,隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),144h金欣組TNF-α、IFN-α表達(dá)明顯下降。 結(jié)論 1.金欣口服液能明顯減輕RSV感染小鼠的肺部炎癥。 2.金欣口服液對(duì)TLR7信號(hào)通路TLR7、MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)有明顯的調(diào)控作用,對(duì)IRF7的表達(dá)在RSV感染早期無明顯調(diào)控,晚期可上調(diào)IRF7的表達(dá)。 3.金欣口服液能夠顯著上調(diào)RSV感染初期TLR7介導(dǎo)的信號(hào)通路下游TNF-α、IFN-α等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)；隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),金欣口服液能適當(dāng)下調(diào)TNF-α、IFN-α的表達(dá),具有雙向動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用。 4.金欣口服液是治療RSV感染的有效藥物,其作用是通過調(diào)節(jié)RSV誘導(dǎo)的TLR7信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,主要依賴的是TLR7/MyD88/NF-κB/TNF-α途徑,在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TLR7/MyD88/IRF7/IFN-α途徑在RSV感染早期作用不明顯。 5. TLR7siRNA轉(zhuǎn)染后,TLR7mRNA及蛋白表達(dá)明顯受抑,但MyD88、 NF-κB mRNA及蛋白的抑制率低于TLR7,表明MyD88、NF-κB的表達(dá)還受其它TLRs調(diào)控,從而說明TLR7信號(hào)通路只是RSV感染后的一個(gè)通路,而金欣口服液亦可通過其它通路調(diào)控下游信號(hào)分子生成,體現(xiàn)了中藥復(fù)方發(fā)揮作用的多靶點(diǎn)效應(yīng)；TLR7siRNA轉(zhuǎn)染與否對(duì)IRF7的表達(dá)無明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R272

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2350636