【摘要】：Rett綜合征(RTT)是一種主要發(fā)生于女性的、X-連鎖的進行性神經(jīng)發(fā)育性疾病,是女性智障的主要遺傳因素之一。其臨床特征為:出生后經(jīng)歷6-18個月正常發(fā)育后,出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩,習(xí)得運動、語言能力、智力退化,并出現(xiàn)手部刻板動作及孤獨癥樣社交障礙,常伴有呼吸功能異常、癲癇發(fā)作等,晚期運動能力喪失。RTT主要由MeCP2基因突變所致,MeCP2蛋白全稱甲基化CpG結(jié)合蛋白,作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子,主要通過調(diào)控與神經(jīng)元成熟和功能維持相關(guān)基因的表達(dá),從而,對維持正常腦功能發(fā)揮起關(guān)鍵作用。探討MeCP2突變導(dǎo)致RTT的病理生理機制對于研發(fā)有效的對因治療手段至關(guān)重要。條件性敲除MeCP2動物模型研究表明,不同神經(jīng)元類型,包括興奮性神經(jīng)元、中間神經(jīng)元、兒茶酚胺能調(diào)制性神經(jīng)元等,均不同程度地參與了 RTT癥狀的不同方面,提示RTT發(fā)生的神經(jīng)元類型特異性,為發(fā)展針對某一類神經(jīng)元的靶向并治療提供了支持證據(jù)。尤其是基于MeCP2-null模型的研究,因類似于MeCP2突變導(dǎo)致的人類疾病狀態(tài),在此基礎(chǔ)上,探討改善某一類神經(jīng)元功能對癥狀表型的逆轉(zhuǎn)效果,可為尋求RTT的靶向治療手段提供較為直接的證據(jù)。膽堿能神經(jīng)元是腦內(nèi)重要的調(diào)制系統(tǒng)之一,主要通過對多個腦區(qū)的廣泛投射、釋放乙酰膽堿遞質(zhì),調(diào)控包括上述RTT相關(guān)神經(jīng)元類型(GABA能中間神經(jīng)元和兒茶酚胺能神經(jīng)元等)在內(nèi)的非膽堿能神經(jīng)元,從而對維持腦的興奮/抑制平衡和多巴胺能神經(jīng)元局部微環(huán)路功能等均具有重要作用。因此,我們把膽堿能神經(jīng)元作為候選目的神經(jīng)元類型,研究其參與小鼠RTT樣表型的特異性作用及其機制。目的:1在Rett綜合征小鼠(缺失MeCP2)中,選擇性激活其膽堿能神經(jīng)元中MeCP2。2檢測膽堿能神經(jīng)元MeCP2選擇性激活對小鼠Rett綜合征樣表型的影響:1)探討在MeCP2缺失小鼠中,選擇性激活小鼠膽堿能神經(jīng)元MeCP2能否有效逆轉(zhuǎn)多數(shù)RTT樣癥狀,從而揭示膽堿能MeCP2在RTT綜合征發(fā)病和治療中地位;2)進一步探討膽堿能MeCP2選擇性激活影響(改善)RTT樣表型的分子機制。從而揭示小鼠Rett綜合征樣表型機制。方法:1通過Chat-Cre;MeCP2lox-Stop系統(tǒng),選擇性刪除膽堿能神經(jīng)元中阻斷MeCP2表達(dá)的Lox-Stop-Lox序列,從而,產(chǎn)生MeCP2僅在膽堿能神經(jīng)元中被激活而正常表達(dá)的小鼠模型。2采用1)各種行為學(xué)檢測方法,系統(tǒng)地檢測選擇性激活膽堿能神經(jīng)元MeCP2小鼠模型的RTT樣表型,主要包括:小鼠運動功能(曠場試驗)、前肢抓力、焦慮樣行為(曠場和高架十字迷宮)、社交行為(三箱試驗)、感覺運動門控功能(PPI檢測),和小鼠一般狀況表型評估(癥狀嚴(yán)重程度評分等);2)Western blot方法,探討膽堿能MeCP2選擇性激活對腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)主要候選分子Chat和Chrna7表達(dá)水平的影響。揭示膽堿能MeCP2對小鼠RTT樣表型的貢獻。結(jié)果:1小鼠模型驗證:1)對Chat-Cre;MeCP2lox-Stop系統(tǒng)繁殖對所產(chǎn)生的子代雄性實驗小鼠進行基因型鑒定分組,包括野生型WT對照組、Cre對照組、MeCP2-Stop組和選擇性激活膽堿能MeCP2的Rescue組。2)進一步免疫熒光檢測,比較各組小鼠MeCP2原位表達(dá)情況及其與膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物Chat的共定位情況,從而,驗證特異性保留膽堿能MeCP2表達(dá)的有效性。結(jié)果顯示:Rescue組中,絕大多數(shù)Chat陽性神經(jīng)元中MeCP2表達(dá)被保留,可用于進一步研究膽堿能MeCP2對小鼠RTT樣癥狀的改善效果,揭示小鼠各種RTT樣表型的機制。2小鼠RTT樣表型檢測:1)小鼠運動能力檢測:(1)曠場測試15分鐘(6-7周),(2)小鼠前肢抓力檢測(8-9周)。結(jié)果顯示:Stop組小鼠表現(xiàn)的各項運動功能減低指標(biāo),在Rescue組中均得到逆轉(zhuǎn)并達(dá)到WT和Cre對照組水平。包括:每5分鐘運動的距離,不動的總時間,大速率(10cm/s)運動的距離,及總運動距離。前肢抓力水平低下也得到相應(yīng)改善、達(dá)到對照組水平。2)小鼠焦慮水平測試:(1)曠場試驗頭5分鐘表現(xiàn)(6-7周),(2)高架十字迷宮(EPM)(6-7周)。結(jié)果顯示:Stop組小鼠在曠場中的焦慮水平增高表型,表現(xiàn)為在曠場中央?yún)^(qū)域的時間和運動距離減低,與之相比,Rescue組小鼠這2項焦慮指標(biāo)均得到顯著逆轉(zhuǎn)、達(dá)對照組水平。然而,在EPM中,Rescue組小鼠和小鼠Stop均表現(xiàn)出相似的異常焦慮水平,表現(xiàn)為在EPM開臂中經(jīng)歷的絕對時間及其所占百分比均增高。3)小鼠社交行為測試——三箱試驗結(jié)果表明:Stop小鼠與陌生小鼠或再次引入的新陌生小鼠之間的交流時間及其偏好指數(shù),較對照組,均表現(xiàn)為異常增加,這一表型在Rescue小鼠中未得到逆轉(zhuǎn)。4)小鼠感覺運動門控功能檢測,結(jié)果顯示:Stop小鼠感覺運動門控功能無明顯異常,膽堿能MeCP2 Rescue對小鼠感覺運動門控功能也無明顯改變效應(yīng)。5)小鼠一般狀況表現(xiàn)評估:(1)體重(6-15周,1次/周),(2)表型嚴(yán)重程度評分(6-15周,1次/周),(3)心率(8周),(4)腦重(8周),(5)壽命。結(jié)果顯示:相對于Stop組小鼠的低體重、嚴(yán)重程度分值進行性增加、心率減低、低腦重和早期死亡表型,在保留膽堿能MeCP2的Rescue小鼠中,上述表型均無顯著改善。3選擇性激活膽堿能神經(jīng)元MeCP2改善小鼠RTT樣表型的分子機制探討通過Western blot進一步探討上述行為改善的可能機制,結(jié)果顯示:候選分子膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物Chat水平及其受體Chrna7全腦表達(dá)水平,在Stop和Rescue小鼠中均無明顯改變,提示膽堿能MeCP2可能并非通過影響膽堿能神經(jīng)元本身遞質(zhì)合成及RTT相關(guān)的乙酰膽堿受體Chrna7水平這一通路,而維持膽堿能神經(jīng)元功能、并影響RTT樣表型。結(jié)論與討論:1選擇性激活膽堿能神經(jīng)元MeCP2,足以有效逆轉(zhuǎn)MeCP2缺失所致運動功能低下。揭示了膽堿能MeCP2對維持小鼠正常運動功能的充分性作用。2選擇性激活膽堿能神經(jīng)元MeCP2,可有效逆轉(zhuǎn)MeCP2缺失所致焦慮樣行為,但對小鼠在EPM中焦慮水平異常減低,無逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。提示膽堿能MeCP2可能具有下調(diào)小鼠焦慮水平的功能,但不足以維持小鼠正常焦慮表型,因而,小鼠正常焦慮樣表型的維持,尚需非膽堿能神經(jīng)元的參與。3膽堿能MeCP2對于MeCP2缺失所致的小鼠社交水平異常增高現(xiàn)象無逆轉(zhuǎn)效應(yīng),提示小鼠正常社交水平的維持,可能主要依賴于非膽堿能神經(jīng)元的作用。4膽堿能MeCP2對于MeCP2缺失所致低體重、低腦重、低心率,表型嚴(yán)重程度評分累加及壽命明顯縮短等一般狀況的改善,可能不是必要的。提示在腦內(nèi)所占數(shù)量有限的膽堿能神經(jīng)元中MeCP2不足以維持小鼠正常一般狀況表型。盡管膽堿能神經(jīng)元功能可廣泛調(diào)控多種非膽堿能系統(tǒng),但小鼠一般狀況的維持,可能主要依賴于非膽堿能系統(tǒng)本身的功能。而處于上游的膽堿能MeCP2,對這一功能無代償效應(yīng),進一步支持MeCP2在神經(jīng)元中主要通過細(xì)胞自主性(cell-autonomous)方式發(fā)揮其維持神經(jīng)元功能的作用。5膽堿能MeCP2可能并非通過影響膽堿能神經(jīng)元本身遞質(zhì)合成關(guān)鍵酶Chat及RTT相關(guān)的乙酰膽堿受體Chrna7水平這一通路,從而維持膽堿能神經(jīng)元功能并影響小鼠RTT樣表型。本課題首次采用選擇性激活膽堿能神經(jīng)元MeCP2小鼠模型,進一步揭示了膽堿能系統(tǒng)中MeCP2在RTT表型及其緩解中的作用,也為膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)治療對有效改善RTT患者運動能力低下和焦慮癥狀的潛能提供了支持證據(jù)。其中的神經(jīng)環(huán)路機制和分子機制,仍有待于進一步研究闡明。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R725.9

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