【摘要】：第一部分GATA-3SNP rs3824662與中國(guó)兒童急性淋巴細(xì)胞 白血病的相關(guān)性 目的：研究GATA結(jié)合蛋白3（GATA-binding protein-3, GATA-3）SNP rs3824662在中國(guó)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）中的分布，分析其與中國(guó)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的相關(guān)性。 方法：收集137例中國(guó)兒童ALL患者及389例非血液系統(tǒng)惡性疾病人員EDTA抗凝靜脈血，提取DNA，采用巢式PCR擴(kuò)增包含GATA-3SNP rs3824662位點(diǎn)的特異性條帶后送公司測(cè)序，對(duì)其進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）分析。SPSS18.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 結(jié)果：基因型C-C、C-A和A-A及等位基因C、A在對(duì)照和中國(guó)兒童ALL中比例沒(méi)有差異，且與ALL的臨床指標(biāo)沒(méi)有相關(guān)性。 結(jié)論： GATA-3SNP rs3824662位點(diǎn)的多態(tài)性改變與中國(guó)兒童ALL的發(fā)病沒(méi)有相關(guān)性，提示該位點(diǎn)與中國(guó)兒童ALL發(fā)病機(jī)制無(wú)關(guān)。 第二部分兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者LAPTM5基因的表達(dá)及臨床意義 目的：溶酶體相關(guān)的五次跨膜蛋白(lysosomal-associated protein transmembrane5,LAPTM5)功能尚不十分明了，本研究通過(guò)定量PCR檢測(cè)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia, ALL）患者骨髓標(biāo)本中LAPTM5mRNA的相對(duì)表達(dá)量，回顧性的分析其表達(dá)水平與兒童ALL臨床特征的相關(guān)性。 方法：病例來(lái)源于2012-2013年期間在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院診斷和治療的ALL患者144例（初診82例、完全緩解54例、復(fù)發(fā)8例）；40例對(duì)照為同期的特發(fā)性血小板減少性紫癜（Idiopathic Thrombocytopenic Purpura, ITP）或細(xì)胞株。應(yīng)用定量RT-PCR方法檢測(cè)LAPTM5基因的mRNA表達(dá)水平，利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件， 分析LAPTM5在兒童ALL中的意義。 結(jié)果：初診患兒LAPTM5mRNA的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.001）；在A(yíng)LL患者中，初診組和復(fù)發(fā)組LAPTM5mRNA的表達(dá)水平均明顯高于緩解組（P0.001，P=0.006），復(fù)發(fā)組與初診組間沒(méi)有差異（P=0.171），復(fù)發(fā)組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033），緩解組與對(duì)照組之間無(wú)差異（P=0.985）。初診B-ALL中LAPTM5的表達(dá)明顯高于兒童初診T-ALL患者。LAPTM5的表達(dá)與骨髓原始細(xì)胞比例呈正相關(guān)(P=0.034, r=0.303)；與年齡、性別、初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白（HB）、血小板(PLT)、C反應(yīng)蛋白（CRP）、乳酸脫氫酶（LDH）、外周血幼稚細(xì)胞比例沒(méi)有相關(guān)性，與兒童ALL的早期治療反應(yīng)及危險(xiǎn)度分級(jí)也沒(méi)有相關(guān)性；與誘導(dǎo)緩解治療33天時(shí)MRD的表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性（P=0.695，r=-0.055）。 結(jié)論：兒童初診ALL高表達(dá)LAPTM5基因，在B-ALL中的表達(dá)高于T-ALL，與骨髓中白血病細(xì)胞數(shù)具有正相關(guān)性，但與疾病的預(yù)后指標(biāo)沒(méi)有相關(guān)性。 第三部分溶酶體五次跨膜蛋白基因的慢病毒載體的構(gòu)建及在K562細(xì)胞中的表達(dá) 目的：構(gòu)建溶酶體相關(guān)五次跨膜蛋白(lysosomal-associated protein transmembrane5,LAPTM5)基因的慢病毒表達(dá)載體，為研究該基因在白血病細(xì)胞中的功能奠定基礎(chǔ)。 方法：以NB4細(xì)胞的cDNA為克隆模板，通過(guò)Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的基因克隆引物，將LAPTM5CDS區(qū)域克隆入pLVX-IRES-Puro慢病毒表達(dá)載體。利用pLVX、pLP-VSVG、pLP1、pLP2慢病毒質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，在293T細(xì)胞中采用磷酸鈣沉淀法包裝LAPTM5過(guò)表達(dá)慢病毒后侵染K562細(xì)胞，并對(duì)LAPTM5過(guò)表達(dá)慢病毒進(jìn)行一系列驗(yàn)證。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)PCR方法，有效擴(kuò)增了LAPTM5基因編碼區(qū),構(gòu)建了pLVX/LAPTM5慢病毒表達(dá)載體，測(cè)序分析表明所克隆的LAPTM5基因編碼區(qū)序列無(wú)誤。DNA水平鑒定表明LAPTM5基因已成功插入到K562細(xì)胞基因組中，且在mRNA和蛋白水平較親本株和轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞高表達(dá)。 結(jié)論：成功地構(gòu)建了人LAPTM5的慢病毒表達(dá)載體pLVX/LAPTM5，，為進(jìn)一步研究LAPTM5在白血病細(xì)胞中的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第四部分LAPTM5基因?qū)562細(xì)胞自噬及凋亡的影響 目的：LAPTM5是溶酶體的重要組成部分，溶酶體是介導(dǎo)自噬的重要器官，本研究通過(guò)觀(guān)察過(guò)表達(dá)LAPTM5基因的K562細(xì)胞自噬及凋亡，探討LAPTM5基因在K562細(xì)胞中的可能作用。 方法：1.用HBSS代替1640完全培養(yǎng)基分別對(duì)轉(zhuǎn)空載體pLVX的K562細(xì)胞和轉(zhuǎn)LAPTM5基因的K562細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，于處理后0h、3h、6h收集細(xì)胞，提取蛋白后蛋白印跡檢測(cè)LC3-II、LC3-I的表達(dá)，并比較其比值。2.使用攜帶FITC的LC3抗體標(biāo)記轉(zhuǎn)空載體pLVX的K562細(xì)胞和轉(zhuǎn)LAPTM5基因的K562細(xì)胞后用成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)帶熒光斑點(diǎn)的細(xì)胞。3.使用LysoSensor Green DND-189標(biāo)記溶酶體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)空載體pLVX的K562細(xì)胞和轉(zhuǎn)LAPTM5基因的K562細(xì)胞，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷溶酶體的酸性程度。4.使用Annexin V-FITC/PI標(biāo)記轉(zhuǎn)空載體pLVX的K562細(xì)胞和轉(zhuǎn)LAPTM5基因的K562細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果：1.細(xì)胞于饑餓處理0h、3h、6h后，轉(zhuǎn)LAPTM5基因的K562細(xì)胞LC3-II/LC3-I比值均低于轉(zhuǎn)空載體pLVX的K562細(xì)胞。2.轉(zhuǎn)空載體的K562細(xì)胞的多數(shù)量熒光斑點(diǎn)的細(xì)胞比率占83.1%，轉(zhuǎn)LAPTM5基因細(xì)胞的多數(shù)量熒光斑點(diǎn)的細(xì)胞比率占57%。3.轉(zhuǎn)空載體的K562細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)LAPTM5基因細(xì)胞熒光強(qiáng)度。4.轉(zhuǎn)LAPTM5基因細(xì)胞的凋亡率為33.1%，.轉(zhuǎn)空載體的K562細(xì)胞凋亡率為34.2%。 結(jié)論：LAPTM5基因能夠抑制K562細(xì)胞的自噬而不影響其凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2329151