【摘要】：第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)對H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用 目的通過體外MSCs與H2O2損傷的PC12細(xì)胞共培養(yǎng)模型，闡明MSCs通過降低凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，從而對H2O2損傷的PC12細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并初步探討其中TLR2相關(guān)信號通路的作用。 方法采用不同濃度的H2O（21.0mM，2.5mM，5.0mM)損傷PC12細(xì)胞1h，同時以未處理PC12細(xì)胞作為對照組，MSCs共培養(yǎng)采用混合培養(yǎng)24h。MTS檢測共培養(yǎng)前后PC12細(xì)胞的存活能力，LDH含量測定和NO釋放實(shí)驗(yàn)分析H2O2對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，Annexin-Ⅴ-EGFP-PI雙染試劑盒檢測PC12細(xì)胞的凋亡情況，鈣影像系統(tǒng)檢測胞內(nèi)Ca2+變化，全細(xì)胞膜片鉗檢測PC12細(xì)胞的靜息膜電位，RT-PCR測定Bcl-2和caspase-3凋亡相關(guān)基因mRNA水平表達(dá)變化，ELISA試劑盒檢測損傷微環(huán)境中相關(guān)細(xì)胞因子的分泌變化，Western Blotting分析TLR2及其信號通路下游核因子NFкB的表達(dá)水平。 結(jié)果（1）經(jīng)RT-PCR檢測，PC12細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)相關(guān)標(biāo)志MAP-2、NSE和Nestin，免疫熒光結(jié)果同樣顯示PC12細(xì)胞內(nèi)有MAP-2表達(dá)。（2）形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)H2O2濃度為1.0mM組的細(xì)胞損傷最輕，與正常對照組相比基本無差別；但隨著H2O2濃度的增高，細(xì)胞損傷程度逐漸加重。MSCs共培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)提示MSCs促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)。（3）MTS分析結(jié)果顯示，2.5mM和5.0mM組細(xì)胞的存活能力較正常對照組分別降低了50%和75%（P㩳0.05vs. control組），而1.0mM組與對照組相比沒有顯著性差異；MSCs共培養(yǎng)組與其他共培養(yǎng)組（條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)組和PC12細(xì)胞共培養(yǎng)組）相比，細(xì)胞的存活能力更強(qiáng)。（4）在LDH檢測實(shí)驗(yàn)中，三組經(jīng)不同濃度H2O2處理的細(xì)胞中LDH的分泌均有增加，與未處理組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P㩳0.05vs.control組）；PC12細(xì)胞損傷后的MSCs共培養(yǎng)組比未損傷共培養(yǎng)組中釋放的LDH略有增加，但是與PC12單獨(dú)損傷組相比，LDH增加的幅度減少（P㩳0.05vs. control組）。（5）NO釋放測定結(jié)果同樣表明，各組H2O2不同處理中的NO含量均高于正常對照組，但僅有5.0mM組與對照組之間存在顯著性差異（P㩳0.05vs. control組）。在損傷后MSCs共培養(yǎng)組中，NO的濃度卻顯著低于未損傷共培養(yǎng)對照組，兩組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（P㩳0.05vs. control組）。（6）Annexin-Ⅴ-EGFP-PI的免疫熒光結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的增高，紅色標(biāo)記的細(xì)胞核逐漸增多；而在MSCs共培養(yǎng)組中基本未見中晚期凋亡的紅色熒光，僅有EGFP標(biāo)記早期凋亡的綠色熒光出現(xiàn)，并隨著H2O2濃度的增高逐漸增多。（7）鈣影像檢測系統(tǒng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源性的NMDA可誘導(dǎo)未損傷的PC12細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+發(fā)生急劇性地外流，而1.0mM和2.5mM H2O2損傷組卻對NMDA的刺激沒有反應(yīng)。通過MSCs與損傷PC12細(xì)胞共培養(yǎng)后，NMDA刺激可引起2.5mM和5.0mM兩組細(xì)胞胞內(nèi)鈣緩慢降低，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P㩳0.05），但1.0mM組與對照組之間沒差別。（8）細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示MSCs共培養(yǎng)后2.5mM組較共培養(yǎng)前有更大的靜息膜電位，共培養(yǎng)體系中1.0mM組和2.5mM兩組較未損傷共培養(yǎng)組具有更大的負(fù)值膜電位（P㩳0.05）；而單獨(dú)損傷各組間無顯著性差異。（9）RT-PCR結(jié)果顯示，在不同濃度H2O2損傷PC12細(xì)胞的各組之間Bcl-2和caspase-3mRNA表達(dá)變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但在損傷PC12細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)組，2.5mM和5.0mM組中Bcl-2mRNA表達(dá)水平顯著高于未損傷共培養(yǎng)組（P㩳0.05），而1.0mM組和對照組相比無明顯差異。與此相反，caspase-3mRNA的表達(dá)水平在5.0mM共培養(yǎng)組中呈明顯下降趨勢。（10）ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-10的分泌在單獨(dú)的PC12細(xì)胞損傷組隨著H2O2濃度的增加而逐漸增高，而在共培養(yǎng)組則逐漸降低；IL-6的分泌水平在MSCs共培養(yǎng)組呈現(xiàn)整體劇增趨勢；共培養(yǎng)前后損傷微環(huán)境中TNF-α、IFN-β、IL-8和NGF等因子的分泌情況在各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。（11）Western Blotting檢測顯示：單獨(dú)損傷組隨著H2O2濃度增高，TLR2的表達(dá)稍有增強(qiáng)；MSCs共培養(yǎng)后各組TLR2表達(dá)水平則逐漸減弱。并且發(fā)現(xiàn)NFкB P65的表達(dá)趨勢與之相同。 結(jié)論（1）MSCs共培養(yǎng)提高了受損傷PC12細(xì)胞的存活能力，同時顯著降低了細(xì)胞凋亡和壞死，對損傷細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。（2）MSCs可上調(diào)Bcl-2、下調(diào)caspase-3，同時分泌IL-6調(diào)節(jié)IL-10的分泌，促進(jìn)PC12細(xì)胞損傷的修復(fù)。（3）MSCs改善損傷PC12細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制可能是通過TLR2→NFкB信號通路調(diào)節(jié)下游細(xì)胞因子的分泌，在損傷局部微環(huán)境中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。 第二部分TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺氧缺血性腦損傷中的調(diào)節(jié)作用 目的明確MSCs移植通過調(diào)節(jié)TLR2信號通路促進(jìn)HIBD大鼠腦損傷的修復(fù)；闡明TLR2信號通路在HIBD過程中的免疫調(diào)節(jié)作用。 方法將180只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）、HIBD造模組、MSCs移植治療HIBD組（MSCs組）及給予Pam3CSK4干預(yù)后HIBD造模組（Pam3CSK4組）。在大鼠7日齡時采用Rice法結(jié)扎并離斷實(shí)驗(yàn)大鼠的左頸總動脈，sham組僅進(jìn)行頸部皮膚切開后縫合，Pam3CSK4組在HIBD損傷前16h經(jīng)腹腔注射給予Pam3CSK430μg/只，MSCs組則在HIBD損傷后24h以腹腔注射方式給予原代培養(yǎng)的MSCs1.5×106cells/只。Morris水迷宮檢測實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)記憶功能；Real-timePCR和Western Blotting方法檢測HIBD后不同時間點(diǎn)各組大鼠損傷側(cè)海馬組織中TLR2的表達(dá)變化，并比較分析HIBD與Pam3CSK4兩組間TLR2及其相關(guān)信號通路因子、凋亡因子Bax的表達(dá)情況；ELISA試劑盒測定大鼠損傷側(cè)海馬組織中IL-10的分泌水平。 結(jié)果（1）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HIBD組實(shí)驗(yàn)大鼠尋找平臺的潛伏期顯著長于sham組(P㩳0.05vs. sham組)，而經(jīng)MSCs移植治療的實(shí)驗(yàn)大鼠尋找平臺所用時間則介于sham組和HIBD組之間，與sham組及HIBD組均有顯著性差異（P㩳0.05）；在第6d的平臺探索實(shí)驗(yàn)中，HIBD組實(shí)驗(yàn)大鼠停留在平臺所在象限的平均時間明顯短于sham組，MSCs組則介于兩者之間，與HIBD組及sham組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）。（2）同時發(fā)現(xiàn)，隨著損傷時間（3d、7d和14d）的延長，HIBD組實(shí)驗(yàn)大鼠損傷側(cè)海馬組織中TLR2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。在對同一時間點(diǎn)不同處理三組（正常對照組、HIBD造模組和MSCs回輸組）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)HIBD組TLR2的表達(dá)水平較sham組高（P㩳0.05vs. sham組）；而MSCs組與HIBD組相比，TLR2的表達(dá)水平卻呈下降趨勢（P㩳0.05vs. HIBD組）。（3）HIBD組大鼠損傷側(cè)海馬組織中IL-10分泌水平明顯高于sham組（P㩳0.05），而MSCs移植治療降低了損傷側(cè)海馬組織中IL-10的水平（P㩳0.05）。（4）相較于HIBD組大鼠，TLR2特異性激動劑Pam3CSK4顯著增加了HIBD實(shí)驗(yàn)大鼠尋找平臺的潛伏期，并降低了損傷大鼠在平臺所在象限停留的平均時間，同時增強(qiáng)了損傷側(cè)海馬組織中TLR2、NFкB和Bax的表達(dá)水平，并使IL-10的分泌增加。 結(jié)論MSCs移植通過下調(diào)TLR2的表達(dá)，降低TLR2信號通路關(guān)鍵核因子NFкB的表達(dá)，減少凋亡因子Bax的表達(dá)水平及IL-10的分泌，從而促進(jìn)HIBD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的修復(fù)。 第三部分TLR2信號通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷中的分子機(jī)制 目的利用MSCs與OGD損傷PC12細(xì)胞共培養(yǎng)模型，通過TLR2特異性激動劑Pam3CSK4或Ad-siRNA激活或沉默TLR2的表達(dá)，驗(yàn)證TLR2相關(guān)信號通路在MSCs修復(fù)神經(jīng)損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。 方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計分為三個組：正常對照組，OGD損傷的PC12細(xì)胞組（OGD組）和MSCs與OGD損傷PC12細(xì)胞共培養(yǎng)組（MSCs共培養(yǎng)組）。OGD組以EBSS置換正常的細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37℃，5%O2+95%N2混合氣中培養(yǎng)6h；MSCs共培養(yǎng)組在OGD損傷結(jié)束后換為正常培養(yǎng)基，同時等比加入MSCs于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。應(yīng)用Real-time PCR和Western Blotting方法檢測三組中TLR2、NFкB P65及凋亡因子Bax的表達(dá)差異，ELISA檢測IL-10的分泌情況。通過TLR2特異性激動劑Pam3CSK4處理（Pam3CSK4組）或感染Ad-siRNA方式（Ad-siTLR2組），激活或抑制PC12細(xì)胞中TLR2的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證TLR2信號通路在MSCs修復(fù)神經(jīng)損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用。其中，Pam3CSK4組在OGD損傷PC12細(xì)胞前6h給予Pam3CSK4，Ad-siTLR2組則在OGD損傷前感染Ad-siTLR2。 結(jié)果（1）缺氧缺糖損傷細(xì)胞后，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)OGD損傷的PC12細(xì)胞折光性差，胞體出現(xiàn)明顯皺縮，凋亡細(xì)胞增多。（2） OGD組與正常對照組相比TLR2的表達(dá)呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢；而MSCs共培養(yǎng)組中TLR2的表達(dá)較OGD組明顯降低，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05vs. OGD組）。TLR2下游信號通路關(guān)鍵核因子NFкB P65的表達(dá)趨勢與TLR2的表達(dá)變化基本一致。OGD組中Bax的表達(dá)較正常對照組明顯升高，細(xì)胞凋亡增多；與MSCs共培養(yǎng)后，Bax的表達(dá)顯著降低（P㩳0.05vs. OGD組）。OGD組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10的含量明顯增多，約為對照組的3倍，但在MSCs共培養(yǎng)組IL-10的分泌較OGD組具有明顯地降低（P㩳0.05vs.正常對照組）。（3）Pam3CSK4及Ad-siRNA均可特異激活或抑制TLR2及NFкB的表達(dá)，分別與自身對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P㩳0.05）。（4）OGD損傷PC12細(xì)胞給予Pam3CSK4處理后，TLR2和NFкB P65的表達(dá)水平均增強(qiáng)，同時伴隨著凋亡因子Bax的升高及IL-10分泌的增多；而感染Ad-siRNA后，TLR2和NFкB P65的表達(dá)水平降低，凋亡因子Bax的表達(dá)也隨之降低，IL-10分泌減少。（5）與MSCs共培養(yǎng)組相比較，Pam3CSK4處理的MSCs共培養(yǎng)組Bax表達(dá)及IL-10分泌明顯升高，感染Ad-siTLR2的MSCs共培養(yǎng)組中的Bax和IL-10隨著TLR2信號減弱而降低。 結(jié)論（1）Pam3CSK4或Ad-siTLR2可有效調(diào)控TLR2及其相關(guān)信號通路中NFкB的表達(dá)水平。（2）OGD損傷可能通過上調(diào)PC12細(xì)胞中TLR2信號通路，，增加Bax表達(dá)和IL-10的分泌水平，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷。（3）MSCs共培養(yǎng)可能通過下調(diào)OGD損傷的PC12細(xì)胞中TLR2信號通路，減少Bax表達(dá)和IL-10的分泌水平，對損傷細(xì)胞的修復(fù)具有保護(hù)作用。（4）在不同處理時細(xì)胞分泌IL-10的水平存在差異，提示IL-10與損傷程度密切相關(guān)；在MSCs修復(fù)神經(jīng)損傷的過程中IL-10發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2285956