【摘要】：目的：缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生兒期危害最大的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，常引起新生兒死亡，存活者也存在不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙。HIBD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，治療主要采取綜合性措施減輕癥狀，對(duì)腦細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，盡量減輕腦組織的進(jìn)一步損害。但是由于圍產(chǎn)期腦細(xì)胞較成年期容易受損以及治療窗口期的問題，導(dǎo)致這些治療措施在新生兒仍需進(jìn)一步探討。而且對(duì)于成熟腦行之有效的治療是否在未成熟腦也能夠表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，以及各種治療方法對(duì)于不斷發(fā)育的腦組織是否具有持續(xù)保護(hù)作用，仍需更多的研究。值得注意的是，在受到損傷同時(shí)，機(jī)體還會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的保護(hù)性因子對(duì)抗損傷反應(yīng)，如何上調(diào)保護(hù)性因子水平且降低損傷性因子水平是臨床治療的重要靶點(diǎn)。 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是突觸可塑性和記憶的重要調(diào)節(jié)因子，在HIBD修復(fù)中起著重要的神經(jīng)保護(hù)作用，而MAPK/ERK信號(hào)通路的激活可以反饋性抑制神經(jīng)元的興奮性毒性，起到神經(jīng)保護(hù)作用，在各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激酶瀑布鏈中,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮保護(hù)作用最可能的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。腦缺氧缺血后磷酸化ERK的高表達(dá)可能是內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)的結(jié)果。缺氧缺血腦損傷后，即刻早基因(Immediate-early Genes,IEGS)如c-Jun在短期內(nèi)迅速表達(dá)，導(dǎo)致了一些后期效應(yīng)基因被抑制或激活，最終神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡。因此采用藥物維持保護(hù)性信號(hào)通路的激活，上調(diào)腦損傷保護(hù)性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平，同時(shí)下調(diào)引起早期神經(jīng)損傷的因子如c-Jun的水平，是臨床治療缺氧缺血性腦損傷的重要思路。 已有的研究和我們的前期研究工作證明，中藥單體白藜蘆醇甙（Polydatin,PD）對(duì)心腦血管具有十分明顯的保護(hù)作用，它具有調(diào)節(jié)血管張力，抑制血小板聚集，改善微循環(huán)，保護(hù)血管內(nèi)皮、抗氧化等作用，并對(duì)腦缺氧缺血后急性期的大腦組織細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。目前，應(yīng)用PD治療急性腦梗塞、帕金森病以及老年性癡呆均已取得很好的臨床效果。這些基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐的結(jié)合為長期尋找一種有效治療新生兒HIBD的潛力藥物提供了新思路，更為重要的是它體現(xiàn)了整體調(diào)節(jié)效應(yīng)的中藥治療疾病宗旨。但是迄今為止，有關(guān)PD對(duì)未成熟腦HIBD后遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其作用機(jī)制的研究甚少。基于以上研究和理論基礎(chǔ)，我們提出設(shè)想，將PD運(yùn)用到新生大鼠HIBD的治療，研究缺氧缺血性腦損傷對(duì)于新生大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的影響，進(jìn)一步探討PD對(duì)于HIBD新生大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用，從蛋白水平通過ERK通路以及神經(jīng)保護(hù)性因子BDNF表達(dá)進(jìn)一步探討其對(duì)于HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力保護(hù)作用的可能機(jī)制，并從即刻早基因c-Jun表達(dá)進(jìn)一步研究其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，旨在進(jìn)一步明確PD對(duì)HIBD的保護(hù)作用及機(jī)制，為PD在新生兒HIE中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 方法： 1.7日齡SD大鼠隨機(jī)分為三組:假手術(shù)對(duì)照組（NS組），缺氧缺血組（HI組），PD干預(yù)組（PD組）。分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈2小時(shí)后吸入含氧8%的氮氧混合氣體2小時(shí)參照Rice方法制備新生大鼠HIBD模型。NS組僅游離左頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎和行缺氧處理，PD組在缺氧缺血后每天腹腔注射0.1％PD10mg/kg10天，NS組和HI組注射等體積無菌生理鹽水。缺氧缺血損傷后24小時(shí)、10天及21天三個(gè)時(shí)間HE染色光鏡下觀察各組大鼠皮層、海馬區(qū)腦組織病理結(jié)構(gòu)的變化。缺氧缺血損傷后21天采用Y-迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的變化。 2.給予PD組新生大鼠0.1％PD10mg/kg干預(yù)治療1天，NS組和HI組注射等體積無菌生理鹽水1天，在缺氧缺血后24小時(shí)Western Blot方法檢測各組大鼠左側(cè)海馬p-ERK，p-CREB表達(dá)的變化，免疫組化方法檢測左側(cè)皮層、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)c-Jun表達(dá)的變化，Western Blot方法檢測左側(cè)海馬c-Jun表達(dá)的變化。 3.給予PD組新生大鼠0.1％PD10mg/kg干預(yù)治療10天，NS組和HI組注射等體積無菌生理鹽水10天，免疫組化方法檢測各組大鼠缺氧缺血后24小時(shí)、10天及21天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)左側(cè)皮層、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)BDNF的表達(dá)變化。WesternBlot方法檢測缺氧缺血后24小時(shí)、10天及21天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠左側(cè)海馬BDNF的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1. Y-迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在第一天的學(xué)習(xí)測試和第二天的記憶保持測試中，同NS組比較，HI組全天總反應(yīng)時(shí)間顯著延長（P 0.01）、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)增加（P0.01），主動(dòng)回避率減少（P0.01）。同HI組比較，PD組全天總反應(yīng)時(shí)間顯著減少（P0.01）、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)減少（P0.01），主動(dòng)回避率增加（P0.01）。 2.跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同NS組比較，在第一天學(xué)習(xí)測試中，HI組反應(yīng)時(shí)間延長（P0.01），錯(cuò)誤次數(shù)增加（P0.01），在第二天記憶保持測試中，HI組潛伏期縮短（P0.01），錯(cuò)誤次數(shù)增多（P0.01）。同HI組比較，在第一天學(xué)習(xí)測試中，PD組反應(yīng)時(shí)間短于HI組（P0.05），錯(cuò)誤次數(shù)少于HI組（P0.01）,且錯(cuò)誤次數(shù)與NS組比較無差異(P0.05)。在第二天記憶保持測試中，PD組潛伏期長于HI組（P0.05），錯(cuò)誤次數(shù)少于HI組（P0.01）,且錯(cuò)誤次數(shù)與NS組比較無差異(P0.05)。 3.缺氧缺血損傷后24小時(shí)，Western Blot結(jié)果顯示NS組大鼠海馬有p-ERK、p-CREB蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)，HI組大鼠海馬p-ERK、p-CREB蛋白表達(dá)較NS組明顯增高（P0.01），PD組大鼠海馬p-ERK、p-CREB蛋白表達(dá)同HI組相比明顯增高（P0.01）。 4.免疫組化結(jié)果顯示，缺氧缺血損傷后24小時(shí),HI組大鼠左側(cè)皮層及海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)BDNF表達(dá)同NS組相比較明顯增高（P0.01）,10天仍高于NS組（P0.01），隨著損傷時(shí)間延長，HI組BDNF的表達(dá)逐漸回落,在21天HI組皮層及海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)BDNF表達(dá)同NS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。PD組呈現(xiàn)出同樣的趨勢，缺氧缺血損傷后24小時(shí),PD組左側(cè)皮層及海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)BDNF表達(dá)同NS組相比較明顯增高（P0.01），皮層、海馬CA1區(qū)與HI組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），CA3區(qū)BDNF的表達(dá)高于HI組（P0.05），缺氧缺血損傷后10天PD組皮層及海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)BDNF的表達(dá)高于HI組（P0.05），21天PD組皮層及海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)BDNF的表達(dá)高于HI組（P0.05）。大鼠左側(cè)海馬BDNF Western Blot結(jié)果同免疫組化結(jié)果相近，缺氧缺血后，HI組及PD組海馬BDNF表達(dá)同NS組相比增高，后隨著時(shí)間延長逐漸回落，缺氧缺血損傷后21天HI組已降至NS組水平，PD組在24小時(shí)（P0.05）、10天（P0.01）及21天（P0.05）BDNF表達(dá)高于HI組。 5.缺氧缺血損傷后24小時(shí),HI組左側(cè)皮層、海馬CA1、CA3及DG區(qū)免疫組化結(jié)果可見c-Jun陽性表達(dá)明顯高于NS組（P0.01），PD組較HI組明顯減少（P0.01）。Western Blot顯示HI組左側(cè)海馬c-Jun的表達(dá)HI組高于NS組（P0.01），而PD組的表達(dá)低于HI組（P0.01）。 6. HE染色結(jié)果顯示光鏡下NS組左側(cè)大腦半球組織皮層、海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)層次清晰，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常。缺氧缺血損傷后24小時(shí)、10天HI組左側(cè)腦組織皮層變薄，海馬錐體細(xì)胞層數(shù)減少，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、溶解，有明顯神經(jīng)元缺失、局灶性壞死。缺氧缺血損傷后21天皮層、海馬等部位形成膠質(zhì)瘢痕。PD組在各時(shí)間點(diǎn)仍有不同程度的神經(jīng)細(xì)胞變性，但多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整，海馬錐體細(xì)胞層細(xì)胞形態(tài)、排列基本正常。 結(jié)論： 1. HIBD可以引起新生大鼠腦組織病理改變和學(xué)習(xí)記憶能力的下降，，應(yīng)用白藜蘆醇甙干預(yù)可以減輕腦組織損傷，改善HIBD新生大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。 2.缺氧缺血性腦損傷后，新生大鼠大腦海馬p-ERK及p-CREB表達(dá)增加，表明MAPK/ERK信號(hào)通路被激活，應(yīng)用白藜蘆醇甙干預(yù)能進(jìn)一步增強(qiáng)海馬p-ERK及p-CREB表達(dá)，提示白藜蘆醇甙干預(yù)對(duì)于學(xué)習(xí)記憶的改善作用可能同其作用于MAPK/ERK信號(hào)通路有關(guān)。 3.缺氧缺血性腦損傷后，新生大鼠腦組織BDNF表達(dá)增加，應(yīng)用白藜蘆醇甙干預(yù)能進(jìn)一步增強(qiáng)HIBD新生大鼠大腦皮層及海馬BDNF的表達(dá)，并且延長其表達(dá)時(shí)間，這可能是白藜蘆醇甙對(duì)于HIBD新生大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。 4.缺氧缺血性腦損傷后，新生大鼠腦組織c-Jun表達(dá)增加，應(yīng)用白藜蘆醇甙干預(yù)降低HIBD新生大鼠大腦皮層、海馬c-Jun的表達(dá)，可能對(duì)缺氧缺血后的神經(jīng)元具有早期保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R722.1;R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2274947