【摘要】：背景急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)患者目前缺乏特效治療藥物,尤其是兒童期患者,病情進展迅速、死亡率極高。即使通過化學(xué)治療達(dá)到緩解,AML患者常因隱藏在骨髓微環(huán)境中微小殘留病灶而再次復(fù)發(fā)。再者,原代AML細(xì)胞在體外條件下易出現(xiàn)自發(fā)性凋亡,而在機體內(nèi)可大量增殖。上述均證明骨髓基質(zhì)細(xì)胞對AML細(xì)胞增殖極其重要。IL-8是一種多細(xì)胞源性促炎因子,它在多種腫瘤患者體內(nèi)高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。國外已有文獻報道,骨髓基質(zhì)細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子,包括IL-8。骨髓基質(zhì)細(xì)胞是否分泌IL-8,IL-8是否夠能促進白血病細(xì)胞增殖等問題國內(nèi)較少報道。本實驗擬采用白血病細(xì)胞株(HL-60)為模型,分離AML兒童患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow stromal cell,BM-MCS),通過采用共培養(yǎng)體系,采用ELISA法檢測共培養(yǎng)體系上清IL-8含量、MTT法檢測HL-60細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60細(xì)胞凋亡率、免疫熒光檢測凋亡蛋白bax表達(dá),進而探討B(tài)M-MCS細(xì)胞能分泌IL-8促進HL-60細(xì)胞增殖,并通過IL-8抗體阻斷加以驗證。實驗有助于闡明骨髓基質(zhì)微環(huán)境對白血病發(fā)病的作用機制,為臨床兒童AML的免疫治療提供理論依據(jù)。目的本實驗擬采用白血病細(xì)胞株(HL-60)為模型,分離AML兒童患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞,驗證AML患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞能分泌IL-8促進白血病細(xì)胞株(HL-60)增殖,闡明骨髓基質(zhì)微環(huán)境對白血病發(fā)病的作用機制,為臨床兒童AML的免疫治療提供理論依據(jù)。方法1.IL-8刺激HL-60細(xì)胞增殖檢測:分別采用不同濃度梯度包括1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml濃度IL-8刺激HL-60細(xì)胞,24h后觀察細(xì)胞形態(tài),并用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。2.密度梯度離心法分選臨床兒童AML患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞。3.骨髓基質(zhì)細(xì)胞與HL-60共培養(yǎng),ELISA法檢測培養(yǎng)上清IL-8含量。4.骨髓基質(zhì)細(xì)胞與HL-60共培養(yǎng),MTT法檢測HL-60細(xì)胞增殖情況,并分析HL-60增殖與IL-8含量的相關(guān)性;5.骨髓基質(zhì)細(xì)胞與HL-60共培養(yǎng),給予IL-8抗體中和上清IL-8,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60細(xì)胞凋亡。6.骨髓基質(zhì)細(xì)胞與HL-60共培養(yǎng),給予IL-8抗體中和上清IL-8,采用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦檢測凋亡蛋白bax表達(dá)。7.統(tǒng)計學(xué)方法:計量數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間差異比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.IL-8刺激HL-60細(xì)胞增殖:采用不同濃度梯度包括1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml濃度IL-8刺激HL-60細(xì)胞,在IL-8濃度小于等于4 ng/ml時,隨著IL-8濃度的增加,HL-60細(xì)胞增殖率不斷增高,當(dāng)IL-8濃度繼續(xù)增加,HL-60細(xì)胞增殖率到達(dá)平臺期,增殖增加不明顯。2.BM-MCS細(xì)胞分泌IL-8:BM-MSC和HL-60細(xì)胞共培養(yǎng),ELISA法檢測培養(yǎng)上清IL-8濃度為(3.83±2.22)ng/ml,空白對照組培養(yǎng)上清IL-8含量為(0.68±0.11)ng/ml,前者顯著高于后者,且有統(tǒng)計學(xué)差異。3.BM-MCS細(xì)胞分泌IL-8刺激HL-60細(xì)胞增殖:BM-MSC和HL-60細(xì)胞共培養(yǎng),MTT法檢HL-60細(xì)胞OD值為(15.16±2.03),空白對照組HL-60細(xì)胞OD值為(10.62±0.90),前者高于后者且有統(tǒng)計學(xué)差異。共培養(yǎng)體系上清IL-8含量與HL-60細(xì)胞增殖存在明顯正相關(guān)(R2=0.7673;P=0.0002)。4.IL-8抗體促進共培養(yǎng)體系中HL-60細(xì)胞凋亡:在BM-MSC和HL-60細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入IL-8抗體,流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60細(xì)胞凋亡率為(8.41±1.70)%,未加入IL-8抗體共培養(yǎng)體系HL-60細(xì)胞凋亡率為(2.00±0.59)%,前者凋亡率高于后者且有統(tǒng)計學(xué)差異。5.IL-8抗體促進共培養(yǎng)體系中HL-60細(xì)胞凋亡蛋白bax的表達(dá):在BM-MSC和HL-60細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入IL-8抗體,免疫熒光結(jié)合激光共聚焦法檢測HL-60細(xì)胞凋亡蛋白bax表達(dá),發(fā)現(xiàn)bax表達(dá)呈現(xiàn)紅色大顆粒狀或小塊狀,說明該組HL-60細(xì)胞凋亡明顯;未加入IL-8抗體共培養(yǎng)體系HL-60細(xì)胞bax表達(dá)呈現(xiàn)微粒狀或粉塵狀,說明該組HL-60凋亡發(fā)生相對較少。結(jié)論1.IL-8能刺激白血病細(xì)胞(HL-60)增殖,增殖率呈現(xiàn)濃度依賴性。2.兒童AML患者BM-MSC細(xì)胞能分泌IL-8,刺激HL-60細(xì)胞增殖,增殖率與IL-8濃度呈正相關(guān)。3.IL-8抗體通過中和兒童AML患者BM-MSC細(xì)胞分泌的IL-8,進而促進HL-60細(xì)胞凋亡,促進其凋亡蛋白bax表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.71

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本文編號：2267221