【摘要】：前言 支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia, BPD)是嚴重威脅小早產(chǎn)兒長期存活和生存質量的一種慢性肺病。BPD發(fā)生的病理改變主要是肺泡簡化和肺血管異常。促進受損肺血管的修復是BPD防治的新思路。內(nèi)皮祖細胞(Epithelial Progenitor Cells, EPCs)是一類具有自我更新和高度增殖能力的血管內(nèi)皮前體細胞。骨髓是多種干/祖細胞的重要儲存池。EPCs的歸巢(homing)是指在某些生理或病理因素刺激下,骨髓內(nèi)EPCs動員進入血循環(huán),動員的骨髓EPCs或者移植的EPCs在歸巢因子的作用下歸巢至外周微血管系統(tǒng),參與血管的生成和修復。研究顯示循環(huán)EPCs的數(shù)量和功能障礙與BPD的發(fā)生有一定的相關性。EPCs用于修復缺血部位的血管的治療策略在臨床上已經(jīng)得到初步嘗試,主要集中于心血管領域。吸入一氧化氮(Nitric Oxide, NO)能降低小早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生率,但是單一治療療效有限。動物研究顯示,吸入NO能促進骨髓EPCs動員至肺,參與急性肺損傷的修復。以上研究啟發(fā)了我們這樣一個假設,吸入NO能否誘導移植EPCs歸巢至肺參與BPD血管損傷的修復。本研究圍繞這樣一個假設,第一部分開展eNOS/NO信號對EPCs歸巢功能的體外研究,第二部分建立大鼠BPD模型,研究外源性靜脈輸入EPCs同時吸入NO誘導移植EPCs歸巢能否達到防治BPD的協(xié)同作用,并對其機制進行研究。希望通過我們的研究能夠為將來臨床移植EPCs同時吸入NO的協(xié)同治療BPD提供些許思路。 第一部分eNOS/NO信號對EPCs歸巢生物學功能影響的體外研究 背景：EPCs是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內(nèi)皮細胞,但尚未表達成熟血管內(nèi)皮細胞表型,也未形成血管的前體細胞。EPCs具有趨向性,在血管損傷發(fā)生后,在細胞因子的作用下,EPCs能夠動員并歸巢至血管損傷部分,參與損傷的內(nèi)皮細胞增殖和修復。表達內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(eNOS)是EPCs的一個重要特征。eNOS可以利用L-Arg、氧氣和輔因子產(chǎn)生NO。eNOS/NO是骨髓EPCs動員的重要信號。eNOS/NO信號在EPCs歸巢中的作用還不完全明了。N(1)-硝-L-精氨酸甲酯(N^-nitro-L-argininemethylester, L-NAME)是eNOS非特異性的抑制劑,可以競爭性抑制eNOS活性,減少NO生成。 目的：分離、純化、培養(yǎng)和鑒定大鼠骨髓來源的EPCs。觀察抑制eNOS活性對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓源性EPCs遷移、增殖、管腔形成等歸巢生物學活性的影響,并初步探討其作用機制。 方法：分離大鼠股、脛骨骨髓中單個核細胞,結合纖連蛋白貼壁篩選法培養(yǎng)細胞,培養(yǎng)7-10天。熒光顯微鏡檢測培養(yǎng)所得細胞結合FITC-UEA-1和攝取Dil-ac-LDL的內(nèi)皮功能能力,采用流式細胞學方法檢測培養(yǎng)所得細胞CD34+比例。用L-NAME抑制培養(yǎng)所得細胞的eNOS活性后,采用細胞培養(yǎng)小室遷移系統(tǒng)、Matrigel體外管腔形成體系、增殖細胞的體外標記結合流式細胞學方法檢測培養(yǎng)所得細胞的遷移、血管樣結構形成和增殖情況。采用實時熒光定量PCR的方法和Western blot的方法檢測CXCR4、CXCR7、VEGFR2和eNOS mRNA和蛋白表達水平。采用硝酸還原酶法檢測細胞分泌NO的水平。 結果：分離所得細胞培養(yǎng)至第5天出現(xiàn)集落樣改變,培養(yǎng)7-10天出現(xiàn)典型的梭形、雙針樣改變,細胞融合度達到80%左右；FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL雙染細胞約85%左右；培養(yǎng)所得細胞CD34+細胞在68.2-72.4%之間。抑制eNOS活性后,細胞遷移能力、增殖情況和管腔形成能力均顯著小于對照組(P0.05)。抑制eNOS活性后,mRNA和蛋白水平上細胞表達CXCR4和eNOS均顯著小于對照組(P0.05),而CXCR7和VEGFR2的1nRNA和蛋白表達受抑制不明顯。抑制‘;NOS活性后,細胞分泌NO的水平顯著小于對照組(P0.05)。 結論：成功分離和純化大鼠骨髓來源的EPCs。eNOS抑制齊L-NAME顯著降低骨髓來源EPCs表達eNOS,減少NO生成。eNOS/NO對EPCs的遷移、增殖和體外管腔形成有調節(jié)作用,對EPCs歸巢分子CXCR4的表達有調節(jié)作用。 第二部分吸入NO誘導EPCs歸巢防治新生大鼠BPD的研究 背景：BPD的發(fā)生是多因素的,其防治策略也包括多個方面,吸入NO和干細胞治療尚處于探索階段。吸入NO在臨床兒科主要用于新生兒低氧性呼吸衰竭和持續(xù)性肺動脈高壓,在BPD的防治療效中作用有限。動物實驗的結果顯示移植EPCs至肺循環(huán)中,可以改善肺血管和肺泡的發(fā)育。有研究顯示吸入NO能動員早產(chǎn)豬骨髓EPCs、增加骨髓源性EPCs在肺內(nèi)定植、減輕肺血管損傷、促進肺修復。急性肺損傷和BPD的發(fā)生在臨床上有一定的相關性和連續(xù)性,那么在BPD的防治策略上,能否將吸入NO和移植EPCs結合起來從而達到協(xié)同防治的目的。本部分通過動物研究,探討吸入NO誘導移植EPCs歸巢至肺對BPD模型的防治作用,并探討其機制,為臨床治療BPD提供一些思路。 目的：建立新生大鼠的BPD模型。研究移植EPCs同時吸入NO對BPD的防治作用,探討吸入NO誘導移植EPCs歸巢至肺的機制。 方法：將新生大鼠暴露于85%高氧中28天建立大鼠BPD模型。采用BrdU體外標記培養(yǎng)的EPCs,通過大鼠尾靜脈注射至體循環(huán)的方法移植EPCs。實驗分為6組,每組15只。空氣組(C組)：空氣中飼養(yǎng)28天。單純高氧組(O組)：85%高氧暴露28天。高氧+EPCs移植組(E組)：85%高氧暴露21天,第22天給予尾靜脈注射EPCs1×105個,繼續(xù)高氧暴露直至28天。高氧+EPCs+L-NAME組(L組)：85%高氧暴露21天,第22天給予尾靜脈注射EPCs1×105個,同時腹腔注射L-NAME (20mg/kg/天),繼續(xù)高氧暴露直至28天。高氧+EPCs+吸入NO組(N組)：85%高氧暴露21天,第22天給予尾靜脈注射EPCs1×105個,同時吸入NO(5ppm,連續(xù)7天）,繼續(xù)高氧暴露7天。高氧+EPCs+吸入NO+L-NAME組：85%高氧暴露21天,第22天給予尾靜脈注射EPCs1×105個,吸入NO (5ppm,連續(xù)7天),同時給予腹腔注射L-NAME (20mg/kg/天),繼續(xù)高氧暴露直至28天。實驗期間每日定時更換飼料、墊料、交換母鼠,觀察仔鼠生長情況和呼吸情況,對氧濃度、濕度和溫度監(jiān)測,實時監(jiān)測吸入NO濃度。實驗結束時留取外周血標本,采用流式細胞學方法檢測循環(huán)CD34+細胞水平；采用ELISA方法檢測血清VEGF的表達。自右心室沖洗肺循環(huán)后留取肺標本。取右肺上葉和中葉組織液氮保存,采用實時熒光定量的方法檢測VEGF、VEGFR2、eNOS和SDF-1mRNA的表達。取右下葉液氮保存,采用Westernblot方法檢測VEGF、VEGFR2和eNOS的表達。。取右肺副葉液氮罐中保存,采用硝酸還原酶法檢測NO表達。左肺4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后留做病理,HE染色分析肺的形態(tài)學改變,并進行輻射狀肺泡計數(shù)：免疫酶組織化學方法檢測肺內(nèi)八因子的表達；免疫酶組織化學方法和熒光免疫組織化學方法觀察移植EPCs在肺內(nèi)的定植情況。 結果：根據(jù)研究目的,將結果分成以下五部分來介紹。 1、BPD模型的建立 新生鼠吸入85%氧氣2周后,毛發(fā)失去光澤,體重增加緩慢,脫氧后有明顯呼吸急促表現(xiàn),重新給氧后,呼吸困難可緩解,至實驗結束時高氧暴露組仔鼠體重顯著小于對照組。肺組織病理切片示：肺泡正常結構消失,肺泡腔直徑擴大,肺泡數(shù)量減少,肺泡間隔增厚。正常組小鼠肺組織病理切片示：肺泡結構規(guī)整,肺泡大小均一,肺泡間隔較薄。 2、吸入NO同時移植EPCs對BPD肺泡數(shù)目和肺血管的影響 肺組織病理顯示高氧干預各組肺泡腔直徑明顯擴大,肺泡數(shù)量減少,肺泡間隔增厚。輻射狀肺泡計數(shù)(Radial alveolar count, RAC)顯示6組仔鼠RAC計數(shù)有顯著差異。兩兩比較顯示,空氣對照組RAC數(shù)目顯著高于其他各組；高氧+EPCs+吸入NO組RAC顯著高于其他高氧干預組。肺組織八因子免疫組化顯示C組、E組和N組的微血管密度分別高于O組、L組和S組。N組的微血管密度顯著高于其他各組。 3、吸入NO同時移植EPCs對循環(huán)CD34+細胞水平的影響 各組仔鼠外周血CD34+細胞水平有顯著差異。兩兩比較顯示,對照組CD34+細胞水平顯著高于O、E、L和S組；外源性輸入EPCs組(E組、N組)的CD34+細胞水平顯著高于高氧組和加用NO抑制劑組(L組和S組)；N組CD34+細胞水平顯著高于其他各組。給予EPCs同時加用eNOS抑制劑組CD34+細胞水平(L組)與單純高氧組無顯著差異,而在給予NO吸入后(S組)可顯著提高CD34+細胞水平。 4、移植EPCs在肺內(nèi)的定植情況 移植EPCs能夠定植于肺組織中,N組EPCsJ肺內(nèi)定植高于其他各組,E組肺內(nèi)定植的EPC高于L組。 5、吸入NO同時移植EPCs對歸巢分子表達的影響(VEGF/VEGFR2、eNOS、 SDF-1、NO) (1)血清VEGF水平的變化 各組血清VEGF水平存在顯著差異。EPCs干預組(E組、L組、N組和S組)的血清VEGF水平顯著高于非EPC干預組(C組和O組)。對照組血清VEGF水平較高氧干預組有增高趨勢。 (2) mRNA水平上VEGF/VEGFR2、eNOS、SDF-1的表達。 各組間VEGFmRNA的表達量有顯著差異。高氧干預各組(O組、E組、L組、N組和S組)的VEGFmRNA的表達量較空氣對照組顯著減少。E組VEGFmRNA水平顯著高于L組和S組；與N組相比,無統(tǒng)計學差異。 各組間VEGFR2mRNA的表達量有顯著差異。高氧干預各組(O組、E組、L組、N組和S組)的VEGFR2mRNA的表達量較空氣對照組顯著減少。O組、E組、L組、N組和S組的VEGFR2mRNA的表達量兩兩比較,無顯著差異。 各組間eNOSmRNA的表達量有顯著差異。C組eNOSmRNA顯著高于O組、L組和S組,而與E組和N組無顯著差異。N組eNOS表達顯著高于O組,有高于E組、L組和S組的趨勢。 各組間SDF-1mRNA的表達量無顯著差異。 (3)蛋白水平上VEGF/VEGFR2和leNOS表達 各組間VEGF表達量有顯著差異。兩兩比較發(fā)現(xiàn),C組和N組VEGF蛋白表達顯著高于其他4組。C組和N組兩組比較無顯著差異。O組、E組、L組和S組VEGF表達無顯著差異。 各組間VEGFR2表達量統(tǒng)計學上無顯著差異。 肺組織各組間eNOS表達量有顯著差異；EPCs干預各組(E組、L組、N組和S組)eNOS表達量顯著大于C組和O組；EPCs干預各組間兩兩比較,eNOS表達量無顯著差異。 (4)NO水平的表達 各組NO表達水平無顯著差異。 結論：吸入NO同時移植EPCs可改善BPD的肺泡化和血管形成。吸入NO可誘導移植EPCs歸巢至肺,主要是通過局部VEGF和eNOS途徑介導的。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R722.6

【參考文獻】

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本文編號：2262724