發(fā)布時(shí)間：2018-09-03 18:33

【摘要】：新生兒高膽紅素血癥及其導(dǎo)致的黃疸是新生兒期常見(jiàn)的臨床癥狀,50%-60%新生兒在出生一周內(nèi)會(huì)經(jīng)歷不同程度的黃疸,早產(chǎn)兒中發(fā)生率更高。大部分黃疸可以自然消退,也有一部分新生兒發(fā)展為嚴(yán)重高膽紅素血癥,引起膽紅素腦病和核黃疸,從而留下聽(tīng)力喪失、腦性癱瘓、智力發(fā)育障礙等后遺癥。在當(dāng)今具有光療、換血等有效治療手段的情況下,嚴(yán)重黃疸的發(fā)生率也有1%。因此對(duì)于新生兒高膽紅素血癥及其高危因素的早期識(shí)別、早期干預(yù)就顯得尤為重要。新生兒黃疸的主要特點(diǎn)是膽紅素生成速率與膽紅素轉(zhuǎn)化及排泄的速率失衡,引起體內(nèi)的膽紅素負(fù)荷過(guò)重,導(dǎo)致黃疸的發(fā)生。人體的膽紅素主要來(lái)源于衰老的紅細(xì)胞。紅細(xì)胞被單核吞噬細(xì)胞吞噬,釋放出血紅蛋白,血紅蛋白被分解成血紅素和球蛋白,血紅素在血紅素加氧酶(Hemeoxygenases, HO)的作用下,將血紅素葉琳環(huán)氧化斷裂,釋放出CO和鐵離子,并形成膽綠素,膽綠素被膽綠素還原酶(Biliverdin reductase isozymes, BVR)還原生成膽紅素。膽紅素從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放到血循環(huán)系統(tǒng),稱為游離(free)膽紅素,也稱為非結(jié)合膽紅素(Unconjugated bilirubin, UCB)。游離膽紅素不溶于水,與血清白蛋白連接,運(yùn)載至肝臟。然后由肝細(xì)胞膜上的特有的一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從血液系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞內(nèi)。在肝細(xì)胞內(nèi)的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)的催化作用下與葡萄糖醛酸結(jié)合形成水溶性、不能透過(guò)半透膜的結(jié)合膽紅素(Conjugated bilirubin, CB),繼而隨膽汁排泄至腸管。目前研究提示,位于肝細(xì)胞竇狀隙膜的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transport proteins, OATPs)參與肝臟對(duì)膽紅素的攝取.有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽屬于OATP超家族,也稱為可溶性陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(solute carrier organic anion transporter, SLCO)超家族。SLCO超家族含有11個(gè)成員,分為6個(gè)家族。膽紅素是OAT1P1及OAT1P3的配體。SLCOIB1, SCO1B3是其編碼基因。膽紅素的代謝及其調(diào)節(jié)過(guò)程復(fù)雜,有多種酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體及調(diào)控因子的參與,其中任一環(huán)節(jié)發(fā)生障礙都可能導(dǎo)致膽紅素負(fù)荷增加,增加新生兒高膽紅素血癥,新生兒黃疸的風(fēng)險(xiǎn)。加之剛出生的新生兒由于本身生理代謝的特點(diǎn),需要適應(yīng)較大的膽紅素負(fù)荷,任何代謝能力的異常,都可能出現(xiàn)比較明顯的癥狀。病理性黃疸尤其是嚴(yán)重黃疸,常常是多種病因共同存在,影響著黃疸的發(fā)生和發(fā)展。環(huán)境和遺傳的因素都可能對(duì)膽紅素水平造成影響,繼而與高膽紅素血癥的發(fā)生相關(guān)。近年來(lái)遺傳因素在新生兒黃疸中的作用逐漸被人們認(rèn)識(shí)。而在黃疸病因的探尋中,遺傳因素又不易被發(fā)現(xiàn)或檢測(cè)。在臨床中我們經(jīng)常會(huì)碰到一部分高膽紅素血癥的黃疸兒,常見(jiàn)的病因檢查都是陰性的,遺傳的缺陷可能是其高膽發(fā)生的重要原因。在臨床上,遺傳性高膽紅素血癥可分為以非結(jié)合性的膽紅素升高為主的高膽紅素血癥和結(jié)合膽紅素升高為主的高膽紅素血癥。大多數(shù)新生兒屬于前一種,初生新生兒中發(fā)生率達(dá)60%以上,它的發(fā)生主要是由于膽紅素生成增加或者是肝臟對(duì)膽紅素的攝取,結(jié)合的異常,是引起膽紅素腦病的原因,已證實(shí)未結(jié)合膽紅素中的游離膽紅素部分是引起膽紅素腦損傷的關(guān)鍵。結(jié)合膽紅素升高為主的高膽紅素血癥比較罕見(jiàn),病因不明,黃疸出現(xiàn)較晚,大部分患兒就診時(shí)已超過(guò)新生兒期,有的已出生后數(shù)月,臨床多表現(xiàn)為肝功能受損和膽汁淤積的癥狀。我們此次研究的高膽紅素血癥的新生兒也都是以非結(jié)合性的膽紅素升高為主的高膽紅素血癥的患兒。疾病相關(guān)基因的研究是了解多因素復(fù)雜疾病遺傳和分子病理機(jī)制的一種重要的方法。隨著DNA研究技術(shù)的發(fā)展,各種基因診斷的手段也被應(yīng)用到不明原因的黃疸病因的探尋和分子機(jī)制的研究當(dāng)中來(lái)�；蛲蛔冇腥N類(lèi)型,點(diǎn)突變,缺失型突變和重復(fù)型突變。黃疸相關(guān)基因的突變大多屬于點(diǎn)突變和重復(fù)型突變。針對(duì)重復(fù)型突變的檢測(cè)方法還比較有限,主要還是依賴于短串聯(lián)重復(fù)序列PCR技術(shù)。用于點(diǎn)突變的檢測(cè)方法比較多,如直接測(cè)序,聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP),變性梯度凝膠電泳(DGGE),以及近幾年發(fā)展起來(lái)的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)(RDB),熒光探針熔解曲線技術(shù),基于變性高效液相色譜的引物延伸法(Primer extention, PE)分析技術(shù),基因芯片技術(shù)和飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)。但在應(yīng)用上存在局限性包括成本高、操作繁瑣、耗時(shí)、相對(duì)低通量、需要特殊儀器和專業(yè)人員及漏檢率高等,不適于大規(guī)模突變/SNP篩查和流行病學(xué)調(diào)查。高分辨熔解(High Resolution Melt, HRM)技術(shù)是近幾年來(lái)在國(guó)際上剛興起的SNP及突變研究工具。該技術(shù)應(yīng)用新型飽和雙鏈DNA結(jié)合熒光染料如LCGrecn,高性能的PCR及熔解設(shè)備,以及專門(mén)的分析軟件。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況,不同SNP位點(diǎn)、雜合子與純合子等都會(huì)影響熔解曲線的峰形,根據(jù)熔解溫度和曲線形狀的改變就可以有效區(qū)分是否存在單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)及不同基因型。這種檢測(cè)方法不受突變堿基位點(diǎn)與類(lèi)型的局限,無(wú)需序列特異性探針,在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解,即可完成對(duì)樣品基因型的分析。敏感度和特異性好。HRM因其操作簡(jiǎn)便、快速,高通量,使用成本低,結(jié)果準(zhǔn)確,并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作而快速成為一種重要基因分型工具廣泛的用于臨床和科研。本研究中,我們以廣東潮州地區(qū)出生的新生兒為研究對(duì)象,調(diào)查了膽紅素生成及代謝相關(guān)的6個(gè)基因G6PD, UGT1A1, HO-1, SLCO1B1, SLCO1B3, BLVRA的多態(tài)在當(dāng)?shù)匦律鷥褐械姆植记闆r,并分析這些多態(tài)與臨床上不明原因新生兒高非結(jié)合性膽紅素血癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。探討新生兒高膽紅素血癥的分子病理機(jī)制。同時(shí)我們采用用高分辨熔解曲線技術(shù),建立一種可對(duì)這些基因中國(guó)人常見(jiàn)的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行快速分子篩查的方法。本次研究的對(duì)象有兩個(gè)來(lái)源,第一部分的新生兒為2010年10月～2012年5月期間在潮州中心醫(yī)院接受新生兒篩查檢測(cè)的新生兒。第二部分的新生兒來(lái)自2011年12月～2014年12月期間在潮州中心醫(yī)院住院的足月新生兒(孕周≥37周,出生體重≥2500g),有嚴(yán)重疾病及重大出生缺陷的新生兒不納入此次研究。根據(jù)其記錄的最高TSB水平,參照黃疸的劃分標(biāo)準(zhǔn),分為黃疸組和非黃疸組。有明確黃疸原因的如ABO溶血,敗血癥,缺血缺氧性腦病的黃疸兒也不納入此研究。2010年5月至2012年12月,共有2500名新生兒(男：1365,女：1135)在潮州中心醫(yī)院進(jìn)行G6PD酶活性熒光法初篩,67名新生兒初篩陽(yáng)性。G6PD缺乏初篩陽(yáng)性率為2.68%(67/2500),男性陽(yáng)性率為3.22%,女性為2.03%。與廣東其它地區(qū)比較,潮州地區(qū)G6PD發(fā)生率低于毗鄰的其他地區(qū)。但根據(jù)世界衛(wèi)生組織的推薦標(biāo)準(zhǔn),建議在男性G6PD缺乏率大于3%-5%的地區(qū)開(kāi)展新生兒G6PD篩查。因此,在該地區(qū)進(jìn)行新生兒G6PD篩查項(xiàng)目還是很有必要的。在這67名懷疑攜帶有G6PD基因突變的新生兒樣本中,58名檢出G6PD基因突變。用高分辨熔解曲線技術(shù)共篩查出7種G6PD突變類(lèi)型(c.95AG,c.392GT, c.493AG,c.871GA,c.1360CT,c.1376GT和c.1388GA)并與測(cè)序結(jié)果吻合。然后,我們挑選了膽紅素代謝途徑的5個(gè)重要基因的11個(gè)SNP,這些SNP位點(diǎn)多位于基因的啟動(dòng)子區(qū)或者基因編碼區(qū),進(jìn)行病例-對(duì)照研究。9個(gè)單核苷酸多態(tài)的基因分型的方法采用的是我們建立的高分辨熔解曲線的方法,并隨機(jī)挑選部分樣本進(jìn)行直接測(cè)序驗(yàn)證。候選SNP,連同其它可能的危險(xiǎn)因素(年齡、性別,孕周)進(jìn)行與新生兒高膽紅素血癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性評(píng)估。經(jīng)分析我們發(fā)現(xiàn)UGT1Al基因上的3個(gè)SNP位點(diǎn)rs4148323,rs6742078和(TA)。的低頻等位基因、基因型及單倍體的頻率在病例組和對(duì)照組新生兒中的分布不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。校正年齡,性別,母乳喂養(yǎng)等與黃疸有關(guān)的危險(xiǎn)因素后,rs4148323,rs6742078和(TA)。位點(diǎn)多態(tài)仍顯示與高膽紅素血癥顯著相關(guān)(P0.01)。攜帶rs4148323低頻等位基因的雜合子及純合子新生兒,也稱為UGT1A1*6(211GA)的攜帶者,其發(fā)生高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)逐漸升高,而rs6742078及(TA)n低頻等位基因攜帶人群其發(fā)生高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)反而降低(ORadj=0.16；p=0.0001 for rs6742807；ORadj=0.25；p=0.000 for(TA)n)。其中UGT1A1*6純合子攜帶者比野生基因型人群其風(fēng)險(xiǎn)增高了12倍(ORadj= 13.02;p =1e-04), UGT1A1*6雜合子的攜帶人群其黃疸風(fēng)險(xiǎn)增加了1.67倍(ORadj＝2.69;p=1e-04)。同樣的,與最常見(jiàn)的單倍型GTA(TA)6相比,ATA(TA)6攜帶人群其發(fā)生高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)增高,而單倍型GAT(TA)7的攜帶人群其發(fā)生高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)反而降低。在剩余的四個(gè)膽紅素代謝基因中,編碼陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽的SLCOs家族中兩個(gè)SNP位點(diǎn)-rs2306283及rs2117032也顯示與增高新生兒高膽風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因突變與母乳喂養(yǎng)對(duì)增高新生兒高膽風(fēng)險(xiǎn)存在疊加效應(yīng)。母乳喂養(yǎng)同時(shí)攜帶有UGT1A1*6雜合或純合突變的新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)最高(OR=5.33；95%CI：1.77-16.10),要顯著高于僅存在母乳喂養(yǎng)或者攜帶UGT1A1*6突變但是人工喂養(yǎng)的新生兒人群(P=0.018)。鑒于UGT1A1在膽紅素代謝中的關(guān)鍵作用,和我們前面的研究。我們選擇對(duì)血清總膽紅素水平超過(guò)342 μmol/L的嚴(yán)重高膽兒進(jìn)行包括UGT1A1啟動(dòng)子TATA盒及所有外顯子基因序列,及與溶血相關(guān)的G6PD基因及地貧基因突變的檢測(cè)。在調(diào)查的58名嚴(yán)重黃疸的新生兒中有7名診斷G6PD酶缺乏,4名檢出攜帶地貧突變基因,44名檢出至少攜帶一種UGT1A1基因功能區(qū)的雜合突變,其中9名為UGT1A1純合突變。除了最常見(jiàn)的UGT1A1基因第一外顯子c.211GA (Gly71Arg)突變,在嚴(yán)重高膽兒中還發(fā)現(xiàn)另外三種UGT1A1外顯子突變類(lèi)型-C.1091CT (Pro364Leu), c.1352CT (pro4511eu),以及c.14561G(Tyr486Asp)。我們還發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重高膽兒同時(shí)攜帶有兩個(gè)或兩個(gè)以上基因突變的也不少。50%G6PD缺乏的高膽兒同時(shí)攜帶有UGT1A1突變,所有四名攜帶有地貧突變基因的高膽兒同時(shí)合并有G6PD缺乏或者UGT1A1基因突變。病例組-對(duì)照組比較,G6PD, UGT1A1基因突變頻率病例組新生兒顯著高于對(duì)照組新生兒。多元logistic回歸分析,校正年齡,性別,母乳喂養(yǎng)等與黃疸有關(guān)的危險(xiǎn)因素后,G6PD缺乏的新生兒其發(fā)生嚴(yán)重黃疸的風(fēng)險(xiǎn)是G6PD正常新生兒的12.87倍(95%CI：1.32～135.87)；攜帶有UGT1A1基因211位雜合突變(G/A)、純合突變(A/A)的新生兒相對(duì)于該位點(diǎn)為野生基因型(G/G)的新生兒其發(fā)生嚴(yán)重黃疸的風(fēng)險(xiǎn)分別提高了2.47倍(OR值為3.47,95%CI：1.26～9.55)和11.46倍(OR值為12.46,95%CI：1.09～142.7)。我們的研究顯示,膽紅素代謝相關(guān)基因的多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性都與不明原因的新生兒高膽紅素血癥相關(guān),反映了病理性黃疸病因的復(fù)雜性。多個(gè)基因,基因與基因,基因與環(huán)境因素的相互作用影響的高膽的發(fā)生和發(fā)展。亞裔人群是黃疸的高發(fā)人群,在新生兒中除了開(kāi)展G6PD篩查項(xiàng)目外,UGT1A1基因檢測(cè),特別是UGT1A1*6的篩查,可作為臨床醫(yī)生對(duì)新生兒黃疸風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估、病因探查及遺傳咨詢的一項(xiàng)輔助檢查。本研究應(yīng)用HRM技術(shù)建立了一種可以對(duì)膽紅素代謝相關(guān)基因中國(guó)人常見(jiàn)的多個(gè)SNP進(jìn)行快速的基因分型的方法,可用于遺傳性高膽紅素血癥的基因診斷還可用于其他膽紅素相關(guān)疾病大規(guī)模的分子流行病學(xué)調(diào)查。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R722.1

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本文編號(hào)：2220818