【摘要】：近年來(lái),國(guó)內(nèi)外多家新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(neonatal intensive care unit, NICU)報(bào)道足月兒與近足月兒呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome, RDS)患病率明顯上升,且具備不同于早產(chǎn)兒RDS的臨床特征,足月兒與近足月兒RDS的病因、發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療方法受到越來(lái)越多新生兒科醫(yī)師的重視。有文獻(xiàn)報(bào)道[4-6],肺液吸收障礙可能直接影響新生兒進(jìn)行正常氣體交換或者通過(guò)影響肺表面活性物質(zhì)的分泌和功能而間接導(dǎo)致新生兒RDS的發(fā)生,而肺泡上皮細(xì)胞是胎兒出生前后控制其肺液分泌和重吸收的主要開(kāi)關(guān)。肺泡上皮細(xì)胞的鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由上皮鈉離子通道(epithelial sodium channel, ENaC)、Na+-K+-ATP酶(NKA)和水通道蛋白(AQP)等組成,其中ENaC在肺液主動(dòng)重吸收中發(fā)揮最關(guān)鍵的作用[4,7-10]。α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC為ENaC的三個(gè)亞單位,在肺泡上皮細(xì)胞中均有其mRNA表達(dá),其中以α-ENaC mRNA表達(dá)量最高,在鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中可能發(fā)揮最重要的作用。據(jù)報(bào)道,將小鼠的α-ENaC基因敲除后,其肺液無(wú)法在圍生期內(nèi)清除干凈,大多于生后40小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)呼吸窘迫癥狀進(jìn)而死于呼吸衰竭;而另外兩種亞型或水通道蛋白(aquaporin, AQP)基因敲除的小鼠,雖然肺液清除的速度有所減慢,但仍可將肺液清除干凈。因此,α-ENaC為肺液經(jīng)由肺泡上皮細(xì)胞進(jìn)行電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵部分,其表達(dá)量和活性降低可能因肺液吸收障礙而導(dǎo)致RDS的發(fā)生[4,5]。如果α-ENaC通過(guò)影響新生兒肺液吸收及肺表面活性物質(zhì)活性而在RDS的發(fā)病機(jī)制中起重要作用,那么編碼α-ENaC的基因SCNN1A則可能是RDS的重要易感基因。SCNN1A基因多態(tài)性可能通過(guò)影響α-ENaC mRNA表達(dá)量和活性而與RDS相關(guān)。攜帶突變等位基因的患兒可能在整個(gè)圍產(chǎn)期通過(guò)抑制α-ENaC mRNA的表達(dá)和功能而影響肺液的清除及肺表面活性物質(zhì)的活性,最終導(dǎo)致RDS的發(fā)生。這是迄今為止首例從肺液吸收的角度研究遺傳基因與RDS發(fā)病相關(guān)性的研究。本課題擬對(duì)不同胎齡RDS患兒進(jìn)行肺表面活性物質(zhì)療效比較,以期觀察是否外源性肺表面活性物質(zhì)替代治療對(duì)所有RDS患兒都有效,對(duì)前期提出的近足月／足月兒RDS病因可能不同于早產(chǎn)兒的設(shè)想進(jìn)行臨床驗(yàn)證。并利用HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)和單體型相結(jié)合的方法,對(duì)SCNN1A基因所有SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析,并從中挑選出與新生兒尤其是近足月/足月兒RDS發(fā)病密切相關(guān)的標(biāo)志性SNP位點(diǎn)。同時(shí)通過(guò)檢測(cè)不同胎齡正常新生兒和RDS患兒鼻腔上皮a-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量,進(jìn)一步驗(yàn)證攜帶易感基因型的新生兒與a-ENaC mRNA表達(dá)及RDS發(fā)病之間的關(guān)系。材料與方法1.不同胎齡RDS新生兒肺表面活性物質(zhì)替代治療療效比較1.1研究對(duì)象收集2010年1月至2013年2月在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院兒科NICU住院治療的168名RDS患兒,均接受外源性肺表面活性物質(zhì)替代治療。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選,最終入選135名RDS患兒,所有研究對(duì)象均為中國(guó)籍漢族。根據(jù)胎齡將其分為3組：組1(早產(chǎn)兒組)：胎齡35周(n=54)；組2(近足月兒組)：35周≤胎齡37周(n=35)；組3(足月兒組)：胎齡37周(n=46)。1.2資料采集收集入組患兒基線資料數(shù)據(jù)(出生體重、性別、分娩方式、5 min Apgar評(píng)分)、RDS病情嚴(yán)重程度、用肺表面活性物質(zhì)前和用肺表面活性物質(zhì)后6小時(shí)血?dú)夥治?pH、PaO2、PaCO2)及氧合參數(shù)(FiO2、OI、PaO2/PAO2)結(jié)果、插管率、機(jī)械通氣時(shí)間、住院時(shí)間、肺表面活性物質(zhì)重復(fù)使用率。1.3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。率的比較用卡方檢驗(yàn)；用藥前后各指標(biāo)比較用配對(duì)資料T檢驗(yàn)；計(jì)量資料符合正態(tài)分布的用單因素方差分析；計(jì)量資料不符合正太分布的用非參數(shù)檢驗(yàn),以中位數(shù)(median)表示。P0.05表示差異顯著。2. SCNN1A基因多態(tài)性與新生兒RDS的關(guān)聯(lián)性研究2.1研究對(duì)象標(biāo)本收集時(shí)間為2012年1月至2014年12月。正常對(duì)照組血液標(biāo)本來(lái)源于重慶市區(qū)及周邊區(qū)縣80家醫(yī)院的產(chǎn)科病房,在新生兒出生時(shí)提取其臍帶血；RDS組血液標(biāo)本來(lái)源于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院兒科NICU病房,取患兒股靜脈血。最終129名正常新生兒、120名RDS患兒為本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,所有研究對(duì)象均為中國(guó)籍漢族。2.2標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性的篩選2.2.1通過(guò)HapMap數(shù)據(jù)庫(kù),獲得中國(guó)漢族人群SCNN1A全基因內(nèi)最常見(jiàn)的SNP位點(diǎn)；2.2.2利用Haploview4.0軟件在SCNN1A基因內(nèi)構(gòu)件單倍域；2.2.3結(jié)合參考文獻(xiàn)挑選本實(shí)驗(yàn)要檢測(cè)的tagSNP位點(diǎn)。2.3基因組DNA提取后利用iMLDR法對(duì)SCNN1A基因型進(jìn)行檢測(cè)2.4統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)�；�資料中計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),率的比較用卡方檢驗(yàn)：各SNP位點(diǎn)分布是否符合Hardy-Weinberg定律、RDS與SCNN1A基因多態(tài)性的相關(guān)性、RDS病情嚴(yán)重程度與SCNN1A基因多態(tài)性的相關(guān)性以及不同胎齡RDS與SCNN1A基因多態(tài)性的相關(guān)性均采用卡方檢驗(yàn)。利用Logistic回歸進(jìn)行校正胎齡、出生體重和性別后RDS與SCNN1A基因多態(tài)性的相關(guān)性分析。P0.05表示差異顯著。3.α-ENaC mRNA表達(dá)水平分析及其與RDS相關(guān)性的初步研究3.1研究對(duì)象收集2014年5月至2015年5月在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院兒科NICU住院治療的57例新生兒,排除9例不合格樣本,最終將48例患兒作為本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,其中正常新生兒26例,RDS患兒22例。所有研究對(duì)象均為中國(guó)籍漢族。3.2利用熒光定量PCR檢測(cè)α-ENaC mRNA的相對(duì)表達(dá)量(POLR2A基因作為內(nèi)參,詳見(jiàn)第四章方法部分)。3.3基因組DNA提取后利用iMLDR法對(duì)SCNN1A基因型進(jìn)行檢測(cè)。3.4統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)�；�資料中計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),率的比較用卡方檢驗(yàn)；不同組別新生兒鼻腔α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)或單因素方差分析；對(duì)α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行ROC曲線繪制及曲線下面積(AUC)的計(jì)算和分析。H-W平衡采用卡方檢驗(yàn)。線性回歸分析評(píng)估基因型與α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性。P0.05表示差異顯著。結(jié)果：1.不同胎齡RDS新生兒肺表面活性物質(zhì)替代治療療效比較1.1用肺表面活性物質(zhì)前后血?dú)饨Y(jié)果比較：用肺表面活性物質(zhì)前三組患兒間PH值、PaO2、PaCO2差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；給予肺表面活性物質(zhì)氣管內(nèi)滴入治療后六小時(shí),胎齡35周早產(chǎn)兒組血?dú)庵笜?biāo)明顯改善：PH值、Pa02較治療前顯著上升,PaCO2較用藥后顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；35周≤胎齡37周的近足月兒組3項(xiàng)血?dú)庵笜?biāo)均無(wú)明顯改善(P0.05)；而胎齡≥37周的足月兒組在用藥后6小時(shí)血?dú)庵笜?biāo)不僅無(wú)明顯改善,反而較用藥前更糟糕：PH值無(wú)顯著變化(P0.05), PaO2顯著降低、PaCO2顯著升高(P0.05)。1.2用肺表面活性物質(zhì)前后氧合參數(shù)比較：用肺表面活性物質(zhì)前三組患兒間FiO2、OI、PaO2/PAO2差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；用肺表面活性物質(zhì)治療6小時(shí)后,胎齡35周早產(chǎn)兒組氧合參數(shù)較用藥前明顯改善：FiO2顯著降低(P0.05),PaO2/PAO2顯著升高(P0.05),OI值無(wú)顯著變化(P0.05)；而胎齡≥35周的近足月和足月兒組在用藥后氧合參數(shù)不僅無(wú)明顯改善,甚至較用藥前更糟糕：FiO2和OI值均顯著升高(P0.05),PaO2/PAO2無(wú)顯著變化(P0.05)。1.3治療結(jié)局：三組患兒氣管插管率、機(jī)械通氣時(shí)間以及存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而住院時(shí)間和肺表面活性物質(zhì)重復(fù)使用率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨著胎齡的增加,住院時(shí)間逐漸縮短,而肺表面活性物質(zhì)重復(fù)使用率明顯增加。2. SCNN1A基因多態(tài)性與新生兒RDS的關(guān)聯(lián)性研究在總樣本中,x2檢驗(yàn)和logistic回歸分析結(jié)果均提示僅位點(diǎn)rs4149570多態(tài)性與新生兒RDS發(fā)病密切相關(guān)(P0.05),其中AA基因型是RDS發(fā)病的高危因素。亞組分析結(jié)果提示,在胎齡大于37周的亞組中,除了SNP位點(diǎn)rs4149570,位點(diǎn)rs7956915多態(tài)性也與RDS發(fā)病相關(guān)(P0.05),兩個(gè)位點(diǎn)均提示僅突變基因型(AA)是新生兒RDS發(fā)病的高危因素；有趣的是,在胎齡小于37周的兩個(gè)早產(chǎn)兒亞組中,未發(fā)現(xiàn)與新生兒RDS發(fā)病相關(guān)的SNP位點(diǎn)(P0.05)。此外,在總樣本中,根據(jù)RDS嚴(yán)重程度將RDS患兒分為4組,之前得到的兩個(gè)陽(yáng)性SNP位點(diǎn)(rs4149570和rs7956915)均與RDS嚴(yán)重程度相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3. α-ENaC mRNA表達(dá)水平分析及其與RDS相關(guān)性的初步研究3.1鼻腔上皮α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量(內(nèi)參基因POLR2A)檢測(cè)結(jié)果RDS患兒α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常新生兒,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。正常新生兒中,胎齡35周組α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于胎齡≥35周組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；35周≤胎齡37周組α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量均值也低于胎齡≥37周組,但差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。然而在RDS患兒中,不同胎齡的3組患兒間α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量并無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.2 α-ENaC mRNA在RDS診斷中的意義ROC曲線下面積(AUC)為0.950,P=0.000,說(shuō)明α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)RDS的診斷有意義。當(dāng)α-ENaC mRNA的相對(duì)表達(dá)量取截?cái)嘀?.82時(shí),其靈敏度為100%,特異度為77.3%,診斷準(zhǔn)確指數(shù)為0.773。3.3 SCNN1A基因SNP位點(diǎn)(rs4149570, rs7956915)與α-ENaC mRNA表達(dá)相關(guān)性分析將基因分型結(jié)果與α-ENaC mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果提示：在RDS組中,位點(diǎn)rs4149570多態(tài)性與α-ENaC mRNA表達(dá)量呈顯著線性相關(guān)(P0.05)；突變型(AA)的α-ENaC mRNA表達(dá)量顯著低于野生型(CC)和雜合型(CA)(P0.05)。而位點(diǎn)rs7956915多態(tài)性與α-ENaC mRNA表達(dá)量無(wú)顯著線性相關(guān)關(guān)系(P0.05)。結(jié)論：1.外源性肺表面活性物質(zhì)替代治療對(duì)于胎齡小于35周的早產(chǎn)兒RDS療效更佳,而近足月／足月兒并未取得同等療效；近足月／足月兒可能存在不同于早產(chǎn)兒RDS的病因和發(fā)病機(jī)制。2. SCNN1A基因rs4149570和rs7956915位點(diǎn)多態(tài)性可能是中國(guó)漢族新生兒尤其是足月兒RDS發(fā)病的重要易感因素,但與RDS嚴(yán)重程度無(wú)相關(guān)性。3.正常新生兒鼻腔上皮α-ENaC mRNA表達(dá)量受胎齡的調(diào)控,隨著胎齡的增加,其表達(dá)量逐漸增加；而RDS患兒α-ENaC mRNA表達(dá)量與胎齡不相關(guān),且顯著低于正常新生兒α-ENaC mRNA表達(dá)量。新生兒鼻腔上皮a-ENaC mRNA的相對(duì)表達(dá)量(內(nèi)參基因P0LR2A)低于0.82可作為臨床預(yù)測(cè)RDS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)性的參考指標(biāo),對(duì)明確呼吸窘迫癥狀患兒病因及指導(dǎo)其治療方案的制定具有重要意義。4. SCNN1A基因rs4149570位點(diǎn)多態(tài)性與α-ENaC mRNA表達(dá)量呈顯著線性相關(guān),攜帶突變基因型(AA)的患兒可能在整個(gè)圍產(chǎn)期通過(guò)抑制α-ENaC mRNA的表達(dá)量而影響肺液的清除或肺表面活性物質(zhì)的活性,最終導(dǎo)致RDS的發(fā)生。5.下一步本課題將在更大的樣本量中利用深入測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步探測(cè)SCNN1A基因中常見(jiàn)突變和罕見(jiàn)突變與RDS的相關(guān)性,并用目前處于國(guó)際前沿水平的肺部超聲技術(shù)對(duì)此類(lèi)患兒因肺液吸收障礙導(dǎo)致RDS予以驗(yàn)證；并對(duì)α-ENaC影響肺表面活性物質(zhì)活性以及糖皮質(zhì)激素通過(guò)上調(diào)α-ENaC mRNA的表達(dá)量而促進(jìn)新生兒肺液吸收的具體機(jī)制進(jìn)行深入研究,為新生兒尤其是近足月／足月兒RDS的救治提供新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R722.1

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