發(fā)布時間：2018-07-18 13:06

【摘要】：目的：支氣管哮喘（bronchial asthma，簡稱哮喘）是以氣道炎癥、氣道重塑、可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性為主要特征的由多種因素引起的一種氣道慢性炎癥性疾病，是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的一種呼吸系統(tǒng)疾病。近二十年來，隨著工業(yè)化和全球污染的加劇，在世界范圍內(nèi)哮喘的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，全球患者約3億左右，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和生存質(zhì)量。加之哮喘病程綿長難愈，給社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所以，哮喘已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題而引起了世界各國的極大關(guān)注。到目前為止，全身或局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素仍然是治療哮喘的首選，但長期應(yīng)用副作用明顯。中醫(yī)中藥防治哮喘應(yīng)該受到重視，特別是在減少副作用，預(yù)防復(fù)發(fā)等方面與西藥比較有一定的優(yōu)勢。本文還概述了歷代中醫(yī)學(xué)家對哮喘的病名、病因病機(jī)、辨證施治的認(rèn)識，對中藥及中醫(yī)藥治療哮喘的現(xiàn)代臨床與機(jī)理研究作了全面總結(jié)。闡述了哮喘的現(xiàn)代流行病學(xué)、病因病機(jī)等。天貝湯是導(dǎo)師郭振武教授的臨床經(jīng)驗方，具有宣肺降氣、化痰平喘之功。本課題在建立大鼠支氣管哮喘模型的基礎(chǔ)上，予天貝湯進(jìn)行干預(yù)，通過對本動物實驗的觀察，選擇與哮喘發(fā)病機(jī)制相關(guān)的多項指標(biāo)，探討天貝湯對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的作用和機(jī)制，為中醫(yī)中藥臨床治療支氣管哮喘提供理論依據(jù)。 材料與方法：72只健康雄性SPF級Wistar大鼠，體重240±20g，實驗動物許可證號SCXK(京)2009-0004，隨機(jī)分為正常對照組、哮喘模型組、天貝湯高劑量組（以下簡稱為高劑量組）、天貝湯中劑量組（以下簡稱為中劑量組）、天貝湯低劑量組（以下簡稱為低劑量組）、小青龍對照組（以下簡稱為小青龍組），每組12只。 天貝湯組成：麻黃、茯苓、清半夏、川貝、天麻等組成，小青龍膠囊組成：麻黃、白芍、細(xì)辛、干姜、炙甘草、桂枝、半夏、五味子。將上方加水煎煮三次合并后過濾。低溫(4℃)放置備用。天貝湯高、中、低劑量組，給藥劑量分別是：高劑量組9ml/kg,中劑量組4.5ml/kg，低劑量組2.25ml/kg，小青龍組給藥劑量0.972g/kg。從第15天開始給藥，直至處死，每日1次灌胃，連續(xù)6周。各組參照呂國平等介紹的方法，分為致敏和激發(fā)兩步。除正常對照組外，實驗第1d和第8d共2次每只大鼠腹腔注射新鮮配制的含10%卵蛋白的生理鹽水1ml（內(nèi)含卵蛋白100mg，氫氧化鋁100mg和滅活百日咳桿菌6×109個）致敏，致敏15d后各組灌胃后1小時后將大鼠放入不完全封閉的霧化吸入箱內(nèi)開始激發(fā)，用超聲霧化器噴入含1%卵蛋白激發(fā)，每次霧化20分鐘，每日1次，激發(fā)6周，激發(fā)后以大鼠煩躁、打噴嚏、咳嗽、抓鼻、大小便失禁、呼吸幅度加深及喘促發(fā)作、紫紺等哮喘發(fā)作癥狀，認(rèn)為哮喘造模成功。正常對照組以生理鹽水代替卵蛋白進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入，霧化流量及時間同前。 第一部分天貝湯對支氣管哮喘大鼠支氣管病理組織學(xué)觀察末次噴霧激發(fā)后18-24h內(nèi)予乙醚麻醉動物，以固定板固定后打開并暴露胸腔，開胸結(jié)扎，剝離肺組織，取出肺組織，于4℃4%多聚甲醛固定，脫水、包埋、切片，HE染色觀察。 第二部分各組大鼠體重和被激發(fā)時的表現(xiàn)的變化 第三部分天貝湯對支氣管哮喘大鼠肺組織核因子-κB（NF-κB）的影響核因子-κB（NF-κB)是一種具有多種功能的核轉(zhuǎn)錄因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，不僅參與哮喘的氣道炎癥反應(yīng)，還參與哮喘氣道重塑的過程。動物分組、模型建立、用藥情況及數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理同前。動物麻醉完全后，取肺組織于4%多聚甲醛固定，脫水、包埋、切片，行免疫組織化學(xué)ABC法染色。 一抗選用兔抗p52(N F-кB的一個亞單位)多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)稀釋度1∶100;用SABC法試劑盒進(jìn)行操作,操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。主要操作步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，3%H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復(fù)1h。滴加山羊封閉血清，濕盒孵育，加入一抗（1:100稀釋）濕盒孵育1h，4℃冰箱內(nèi)過夜，PBS漂洗，加入生物素化二抗37℃孵育，PBS漂洗5min，3次。⑧滴加ABC復(fù)合物37℃孵育30min，PBS漂洗5min，3次。⑦二氨基聯(lián)苯胺(DAB)光鏡下顯色5-15min，終止呈色反應(yīng)。蘇木精襯染，常規(guī)裱片、封片和觀察。計算機(jī)圖象處理軟件半定量測定NF－κB表達(dá)。 第四部分天貝湯對支氣管哮喘大鼠血清中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）的影響。 氣道重塑是慢性哮喘反復(fù)發(fā)作的重要病理生理基礎(chǔ)，它與哮喘肺功能損害及氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積和降解的失衡是導(dǎo)致氣道壁結(jié)構(gòu)異常、間質(zhì)增生和肺實質(zhì)破壞的重要原因，ECM主要由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）來降解,其中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是鋅依賴性蛋白酶，MMP-9催化集團(tuán)區(qū)含有3個重復(fù)的類Ⅱ型纖維連接蛋白結(jié)合區(qū)，決定了它對明膠和彈力纖維的底物特異性，主要降解Ⅳ型以及Ⅴ型膠原。近來研究表明MMP-9在支氣管哮喘患者的氣道炎癥和氣道重塑中發(fā)揮重要作用。 動物分組、模型建立、給藥情況及數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理同第一部分。動脈血血清中MMP-9、TIMP-1含量檢測：采用雙抗體夾心法ABC-ELISA法測定MMP-9、TIMP-1含量，具體方法如下。 ①建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中加入樣品稀釋液100μl，第一孔加入標(biāo)準(zhǔn)品100μl，混勻后用加樣器吸出100μl，移至第二孔，如此反復(fù)行對倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100μl棄去，使之體積為100μl，第八孔為空白對照。 ②加樣：待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl。 ③將反應(yīng)板充分混勻后放置37℃120分鐘。 ④洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。 ⑤每孔中加入第一抗體工作液50μl，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。 ⑥用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。 ⑦每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μl，將反應(yīng)板置37℃60分鐘。 ⑧用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次。每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗處反應(yīng)5-10分鐘。每孔加入1滴終止液混勻，在492nm處測吸光值。 以標(biāo)準(zhǔn)品2000、500、250、125、62、31、0ng/ml之OD值在半對數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值在該標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出MMP-9的含量，TIMP-1方法同MMP-9。第五部分天貝湯對支氣管哮喘大鼠肺組織表面相關(guān)凋亡基因蛋白Fas和Bcl-2表達(dá)的影響 動物分組、模型建立、用藥情況及數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理同前。動物完全麻醉后，取肺組織，加入Trizol充分勻漿，提取總RNA，采用RT-PCR法檢測各組大鼠肺組織中相關(guān)凋亡基因蛋白Fas和Bcl-2表達(dá)的變化。 統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（—x±s)表示，用SPSS統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析及LSD檢驗。顯著差異水平以0.05和0.01為標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 1.天貝湯對哮喘大鼠支氣管-肺組織病理學(xué)的影響 肺組織肉眼形態(tài)觀察:正常對照組:肺組織顏色淡紅，肺組織柔軟而富有彈性，表面光滑。哮喘模型組:肺組織過度膨脹，部分肺組織顏色變深，呈暗紅色，質(zhì)地稍硬，表面有呈顆粒狀的瘀點。天貝湯各劑量組和小青龍組肺組織顏色稍暗，膨脹不明顯，無瘀斑瘀點。光鏡觀察：正常對照組：大鼠支氣管內(nèi)及其周圍無明顯的炎性細(xì)胞浸潤，支氣管壁完整光滑，細(xì)胞排列規(guī)整，平滑肌層厚度正常，支氣管粘膜規(guī)整，管腔內(nèi)無脫落上皮細(xì)胞。模型組：支氣管管壁及伴行的動脈周圍有大量嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)容物增多，微血管滲漏，可見管腔內(nèi)炎性分泌物增多，有的小支氣管甚至被粘液栓及炎性細(xì)胞所堵塞。杯狀細(xì)胞增生，氣道上皮指狀增生，平滑肌層增厚，排列紊亂，支氣管粘膜水腫增厚，上皮脫落，上皮下纖維化，支氣管粘膜皺壁增多、延長。 高劑量組：嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，幾乎消失，水腫明顯消失，管壁和平滑肌層厚度接近正常對照組,逐漸恢復(fù)，支氣管粘膜規(guī)整，支氣管管腔內(nèi)偶見脫落上皮細(xì)胞及粘液。 中劑量組：嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤有所減少，管壁和平滑肌層厚度有所減少，氣管管壁結(jié)構(gòu)層次清楚，支氣管管腔內(nèi)偶見脫落上皮細(xì)胞及黏液，管腔滲出物逐漸吸收。 低劑量組：支氣管周圍嗜酸性粒細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞浸潤略微減少，管壁和平滑肌層厚度略減少，管腔內(nèi)偶見脫落上皮細(xì)胞及黏液。 小青龍組：黏膜下層見輕度充血水腫及少量炎癥細(xì)胞，管腔內(nèi)見炎性滲出物，粘膜增生，支氣管腔內(nèi)少量脫落細(xì)胞和粘液。 2.各組大鼠體重和被激發(fā)時的表現(xiàn)的變化 體重：激發(fā)后各組大鼠體重均增�？瞻捉M大鼠體重與其余各組有差異，高于其余各組(p0.01)；高、中、低劑量組，小青龍組及模型組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。被激發(fā)時的表現(xiàn)：空白組大鼠表現(xiàn)活潑好動，動作靈敏，毛色光滑，呼吸平穩(wěn)。模型組大鼠在吸入OVA后不久即出現(xiàn)過敏癥狀如：躁動不安，搔抓、舔肢體、打噴嚏等，繼而大鼠反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)呼吸急促，呼吸困難(明顯的腹式呼吸)，伴輕度紫紺，部分大鼠可聞及響亮的呼氣相喘鳴音和不規(guī)則呼吸。與哮喘模型組比較，高、中劑量組癥狀減輕，無呼吸急促，無紫紺，無呼氣相喘鳴音；低劑量組和小青龍組呼吸稍急促，無紫紺，喘鳴音減輕。在高中低劑量組比較中，高劑量組較低劑量組比較有明顯好轉(zhuǎn)，沒有呼吸急促和呼吸困難癥狀，大鼠毛色光澤較好，精神也較好。 3.對哮喘大鼠支氣管NF－κB表達(dá)的影響 與正常對照組比較，模型組NF－κB表達(dá)明顯增加，差異具有顯著性意義（P0.01）。與模型組比較，NF－κB在各治療組陽性表達(dá)減少，高劑量組降低最明顯（P0.01），其次為中劑量組、小青龍組、小劑量組；與小青龍組對比，高劑量組NF－κB含量低，二者差異具有顯著意義p0.01㖞。 4.對支氣管哮喘大鼠動脈血清中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的影響。 與正常對照組相比，，模型組大鼠MMP-9、TIMP-1含量明顯升高，差異具有顯著性意義p0.01㖞，證明哮喘模型建立成功；與模型組比較，各治療組MMP-9含量均降低，高劑量組降低最明顯p0.01㖞，其次為中劑量組、小青龍組，低劑量組次之。與小青龍組相比，高劑量組含量低，二者差異具有顯著意義p0.01㖞。 5.對支氣管哮喘大鼠相關(guān)基因蛋白Fas mRNA、Bcl-2mRNA表達(dá)的影響。 與正常對照組比較，模型組Bcl-2mRNA表達(dá)明顯增多(P㩳0.01)，F(xiàn)as mRNA表達(dá)明顯減少p0.05㖞；與模型組比較，各治療組Bcl-2mRNA表達(dá)減少，高劑量組減少最明顯p0.01㖞，其次為中劑量組、小青龍組、小劑量組，與小青龍組比較高、中、低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義；與低劑量組比較，高劑量組Bcl-2mRNA表達(dá)強(qiáng)度低，二者差異具有顯著意義p0.05㖞。與模型組比較，F(xiàn)as mRNA在各治療組表達(dá)有所增多,高劑量組增多最明顯p0.05㖞，其次為中劑量組、小青龍組、小劑量組，但均無統(tǒng)計學(xué)意義；與小青龍組比較高、中、低劑量組均無統(tǒng)計學(xué)意義。與低劑量組比較，高、中劑量組、小青龍組均無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1.哮喘發(fā)病與痰、風(fēng)等致病因素有關(guān)。風(fēng)盛痰阻、氣道攣急是哮喘發(fā)作的主要病機(jī)，治療以宣肺降氣、化痰平喘及調(diào)理臟腑并舉。 2.天貝湯具有宣肺降氣、化痰平喘及調(diào)理臟腑的作用，對哮喘有確切的治療作用。 3天貝湯治療哮喘的作用機(jī)制 3.1對氣道重塑的影響。對支氣管-肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，模型組支氣管粘膜上皮部分脫落，黏膜下層充血水腫，嗜酸性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤，黏膜下平滑肌顯著增生肥厚。與正常對照組相比，模型組出現(xiàn)氣道重塑。經(jīng)天貝湯治療后，氣管管壁結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，炎癥明顯減輕，水腫明顯消失，增生的平滑肌細(xì)胞基本恢復(fù)正常。提示天貝湯具有抑制哮喘豚鼠氣道重塑，從而發(fā)揮平喘作用。其機(jī)制可能是通過減少氣道EOS浸潤，減少炎癥介質(zhì)分泌、釋放，減輕炎性細(xì)胞滲出，抑制杯狀細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增生，從而減輕氣道炎癥反應(yīng)，抑制氣道重塑。 3.2天貝湯能降低支氣管哮喘大鼠肺組織中NF－κB的含量，從而從細(xì)胞因子角度解釋天貝湯對氣道炎癥的抑制作用。 3.3天貝湯抑制氣道重塑和細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用可能與其降低動脈血清中MMP-9、TIMP-1含量有關(guān)。 3.4天貝湯抑制氣道炎癥和氣道重塑的作用可能與其降低肺組織中Bcl-2mRNA表達(dá)，增加Fas mRNA表達(dá)有關(guān)。 4.天貝湯對實驗性哮喘大鼠的平喘作用，具有劑量依賴關(guān)系，并且部分優(yōu)于經(jīng)典方劑小青龍湯，其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。天貝湯通過多途徑、多層次、多靶點抑制氣道炎癥和氣道重塑，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R285.5;R272

【引證文獻(xiàn)】

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1 李萍;史鎖芳;;中藥對實驗性哮喘核因子-κB信號通路影響的研究進(jìn)展[J];河北中醫(yī);2014年06期

本文編號：2131987