本文選題：孕期炎癥 + 驚厥　； 參考：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景 癲癇(epilepsy)是一種大腦神經(jīng)元發(fā)作性異常放電引起的,以反復(fù)癇樣發(fā)作(seizure)為特征的臨床癥候群,是常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病。驚厥以強(qiáng)直或陣攣等骨骼肌運(yùn)動(dòng)性發(fā)作為主要表現(xiàn),常伴意識(shí)障礙。由于驚厥是癇性發(fā)作的常見形式,常常被當(dāng)做癇性發(fā)作的同義詞。兒童及成人癲癇發(fā)病率高,長(zhǎng)期反復(fù)癇性發(fā)作會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的腦損傷甚至持久性精神行為障礙,給患者本人、家庭及社會(huì)造成很大的困擾。癲癇的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,大量研究表明,癲癇發(fā)病與神經(jīng)遞質(zhì)失衡、離子通道、遺傳及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞異常有著密切關(guān)系。近年來,關(guān)于癲癇的病因、發(fā)病機(jī)制及治療等的研究工作取得了很大進(jìn)展,但是癲癇發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚未完全闡明。 星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成成分,與大腦的發(fā)育、正常生理活動(dòng)、神經(jīng)病理過程、以及損傷與修復(fù)有著密切的聯(lián)系。神經(jīng)炎癥主要以膠質(zhì)細(xì)胞(特別是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)活化、增生并分泌促炎癥細(xì)胞因子如白介素-1β (IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNFa)、白介素-6(IL-16)及抗炎細(xì)胞因子白介素-10(IL-10)等為特點(diǎn)。近年來,越來越多的研究數(shù)據(jù)表明大腦炎癥反應(yīng)參與癲癇發(fā)生及發(fā)展過程。許多研究顯示癲癇發(fā)病過程中伴有小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化增生與大量促炎癥細(xì)胞因子生成。適度的神經(jīng)炎癥是大腦應(yīng)對(duì)損傷的保護(hù)性反應(yīng)。然而,過度持續(xù)膠質(zhì)細(xì)胞活化及其產(chǎn)生的大量促炎細(xì)胞因子不僅可使血腦屏障完整性被破壞,通透性增加,促進(jìn)炎癥細(xì)胞進(jìn)一步浸潤(rùn),也可使神經(jīng)元興奮性增高,升高驚厥易感性并能加劇癲癇打擊導(dǎo)致的腦損傷。因此,過度持續(xù)大腦炎癥反應(yīng)與癲癇發(fā)作互為因果,促進(jìn)癲癇的發(fā)生發(fā)展。 近年來,大量研究表明,生命早期炎癥不僅可導(dǎo)致急性腦損傷更可對(duì)大腦、心理及行為發(fā)育產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)影響。胎兒發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期子宮微環(huán)境的紊亂可導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)育異常,增加生后罹患神經(jīng)、精神及行為障礙的風(fēng)險(xiǎn)。臨床上,母親孕期病毒或細(xì)菌感染均與后代孤獨(dú)癥、精神分裂癥及腦癱的發(fā)生有關(guān)。例如,前瞻性流行病學(xué)研究顯示母親孕期弓形蟲、生殖系感染及感冒均可使得后代精神分裂癥發(fā)病危險(xiǎn)性增高。此外,新生兒期炎癥刺激也可導(dǎo)致代謝、免疫及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生長(zhǎng)期功能性改變,增加青少年期甚至成年后神經(jīng)精神疾病及行為障礙易感性。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過制作母體免疫激活(maternal immune activation, MIA)嚙齒類動(dòng)物模型來測(cè)定孕期感染對(duì)后代的生理及行為效應(yīng)。在這些研究中,常通過給孕鼠注射脂多糖(LPS)或人工合成的雙鏈RNA聚肌胞苷酸(polyI:C),以刺激孕鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答,來分別模擬母體細(xì)菌或病毒感染。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的主要組成成分,可通過與某些細(xì)胞表面的Toll樣受體4(toll-like receptor-4, TLR4)及TLR2結(jié)合,激活核因子-kB (nuclear factor-κB, NF-κB),從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。在MIA模型中,孕期LPS刺激可使得孕鼠血清、胎盤及羊水中促炎細(xì)胞因子mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)。大劑量LPS甚至可導(dǎo)致胎鼠大腦炎性細(xì)胞因子表達(dá)升高。另外,有研究顯示大鼠孕期及新生兒期暴露于LPS可導(dǎo)致大腦海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化一直持續(xù)到成年期。由于大腦炎癥反應(yīng)可促進(jìn)癲癇發(fā)生發(fā)展,我們推測(cè)孕期及新生兒期炎癥刺激可能會(huì)增加兒童期及成年期驚厥易感性。 與我們的推測(cè)相符,近年來,流行病學(xué)調(diào)查資料證實(shí)母親妊娠期巨細(xì)胞病毒感染、陰道酵母菌感染、膀胱炎、持續(xù)性咳嗽大于7天及持續(xù)性腹瀉大于4天均可增加后代兒童期癲癇發(fā)病危險(xiǎn)性。母親產(chǎn)時(shí)感染也可升高新生兒驚厥易感性。最近國(guó)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠新生兒期炎癥刺激可增加成年期驚厥易感性。然而,孕期感染能否增加后代兒童期及成年期驚厥易感性,生命早期炎癥能否加劇癲癇打擊造成的腦損傷,能否導(dǎo)致長(zhǎng)期腦發(fā)育及行為異常及其可能的機(jī)制,至今,未有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道。對(duì)上述問題的深入研究,有助于進(jìn)一步闡明癲癇及其相關(guān)腦損傷的發(fā)病機(jī)制,為其臨床防治提供新的思路。 第一章孕晚期免疫激活對(duì)子代青少年大鼠驚厥易感性的影響 研究目的： 研究母體孕晚期免疫激活對(duì)子代青少年大鼠驚厥易感性及相關(guān)腦損傷的影響及其可能的機(jī)制。研究方法： 1.孕晚期免疫激活模型的建立 給予雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠在孕齡19天及20天時(shí),連續(xù)兩天腹腔注射脂多糖(LPS),每次300ug/kg,以構(gòu)建孕晚期免疫激活大鼠模型；對(duì)照組孕鼠腹腔注射相同容積的生理鹽水(NS)。觀察兩組孕鼠的分娩時(shí)間、產(chǎn)仔量及新生仔鼠出生體重。 2.子代青少年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的建立 選用生后21天(postnatal day21, P21)的雄性子代青少年大鼠并隨機(jī)分組。將海人酸(kainic acid, KA)按照7.5mg/kg給予癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)組大鼠腹腔注射,觀察大鼠行為變化。癇性發(fā)作行為學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：正常行為狀態(tài)；Ⅰ級(jí)：凝視、咀嚼、動(dòng)須或頭面部輕微顫動(dòng)；Ⅱ級(jí)：點(diǎn)頭、甩尾、搔抓,濕狗樣抖動(dòng)；Ⅲ級(jí)：一側(cè)前肢局限性陣攣；Ⅳ級(jí)：伴后肢站立的全身強(qiáng)直性陣攣發(fā)作；Ⅴ級(jí)：出現(xiàn)站立并摔倒的全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作。持續(xù)觀察大鼠行為,記錄發(fā)作的等級(jí)及出現(xiàn)時(shí)間。持續(xù)全身發(fā)作或連續(xù)多次全身發(fā)作之間不能恢復(fù)正常狀態(tài)超過30min者為SEC(Ⅳ-Ⅴ級(jí))。在SE開始后2小時(shí)給予水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作。僅發(fā)作達(dá)Ⅳ或Ⅴ級(jí)的大鼠納入后續(xù)試驗(yàn)。未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的子代大鼠予以剔除。對(duì)照組青少年大鼠給予腹腔注射相同容積的NS。子代大鼠腹腔注射觀察行為變化后送回至原母鼠籠。 這樣,腹腔注射KA或NS的青少年大鼠已經(jīng)被隨機(jī)分為4組,正常對(duì)照組(NS-NS),生前炎癥組(LPS-NS),海人酸致癇組(NS-KA)和“二次打擊”組(LPS-KA)。 3.驚厥易感性測(cè)定 海人酸注射后,首次癲癇發(fā)作開始時(shí)間(seizure onset time, SOT)作為癲癇發(fā)作的潛伏期。我們將大鼠前肢局限性陣攣、后肢站立或身體失衡作為首次癇性行為。本研究中,我們用SOT來衡量青少年大鼠對(duì)海人酸的驚厥易感性。 4.SE后6h,隨機(jī)選擇各組大鼠,采用實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù),檢測(cè)炎性因子IL-1β、TNFα、IL-6及IL-10表達(dá)情況。 5.SE后24h及3d時(shí),隨機(jī)選擇各組大鼠,分別采用Western blot方法及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物,離子鈣接頭蛋白分子1(Iba1)和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物,膠原纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)變化。 6.SE后3d,隨機(jī)選擇各組大鼠,采用NeuN免疫組織化學(xué)染色、尼氏染色和FJB染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及損傷情況。 7.在P70時(shí),采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),測(cè)定各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力。 8. Morris水迷宮測(cè)試后,采用曠場(chǎng)試驗(yàn)測(cè)定各組大鼠自發(fā)活動(dòng)水平及探索能力。結(jié)果： 1.孕期脂多糖刺激對(duì)孕鼠分娩時(shí)間、產(chǎn)仔量及子代鼠體重的影響。 暴露于LPS組孕鼠與NS注射組孕鼠在分娩時(shí)間及產(chǎn)仔量上無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。LPS暴露組新生鼠平均出生體重較NS注射組顯著減低。此外,LPS暴露組子代鼠P9體重也較NS注射組子代鼠顯著減低。LPS刺激組及NS注射組子代鼠P21體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.孕期暴露于LPS導(dǎo)致子代鼠青少年期KA所致驚厥易感性增加。 腹腔注射KA后,LPS暴露組子代鼠(LPS-KA) SOT較NS注射組子代鼠(NS-KA) SOT縮短,表明孕期LPS刺激可導(dǎo)致子代鼠青少年期KA所致驚厥易感性增加。 3.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后6小時(shí),各組大鼠海馬炎癥因子的表達(dá)情況。 RT-PCR定量分析結(jié)果顯示： (1)生前炎癥組(LPS-NS)IL-1βmRNA、TNFamRNA、IL-6mRNA及IL-10mRNA的表達(dá)與正常對(duì)照組(NS-NS)無顯著差異； (2)KA致癇組(NS-KA)IL-1βmRNA、TNFamRNA、IL-6mRNA及IL-10mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組(NS-NS)均增高; (3)與NS-KA組相比,LPS-KA組IL-1βmRNA及IL-6mRNA表達(dá)增高；然而,IL-10mRNA與TNFamRNA的表達(dá)在LPS-KA組與NS-KA組間無差異。 4.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后,各組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況 Western blot與免疫組化染色均顯示,與NS-NS組相比,LPS-NS組、NS-KA組大鼠海馬Ibal蛋白表達(dá)水平升高；與NS-KA組相比,LPS-KA組大鼠海馬Ibal蛋白表達(dá)水平升高。Ibal蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期活化,并能加劇KA所致海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。 5.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后,各組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況 Western blot與免疫組化染色均顯示,與NS-NS組相比,LPS-NS組、NS-KA組大鼠海馬GFAP蛋白表達(dá)水平升高；與NS-KA組相比,LPS-KA組大鼠海馬GFAP蛋白表達(dá)水平升高。GFAP蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期活化,并能加劇KA所致海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。 6.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后3天,各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷情況 尼氏染色顯示NS-NS組大鼠海馬CA1區(qū)無神經(jīng)元損傷,形態(tài)正常。LPS-NS組、NS-KA組及LPS-KA組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)元損傷,表現(xiàn)為尼氏染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,形態(tài)異常。與NS-KA組相比,LPS-KA組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷加重。尼氏染色結(jié)果表明生前炎癥刺激可產(chǎn)生長(zhǎng)期效應(yīng)：生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后海馬神經(jīng)元損傷,并能加劇KA所致海馬神經(jīng)元損傷。 NeuN與FJB染色結(jié)果同尼氏染色結(jié)果相似。7.P70時(shí),Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶情況 在Morris水迷宮尋找隱藏平臺(tái)的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中,隨著訓(xùn)練進(jìn)展,各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。與NS-NS組相比,LPS-NS組及NS-KA組大鼠尋找到平臺(tái)的潛伏期明顯增長(zhǎng)。與NS-KA組相比,LPS-KA組大鼠尋找到平臺(tái)的潛伏期明顯增長(zhǎng)。 在Morris水迷宮探索試驗(yàn)中,與NS-NS組相比,LPS-NS組與NS-KA組大鼠目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比明顯縮短。與NS-KA組相比,LPS-KA組大鼠目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比明顯縮短。 8.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,各組大鼠自發(fā)活動(dòng)水平及探索能力表現(xiàn)情況 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)自發(fā)活動(dòng)結(jié)果顯示,各組大鼠水平穿越方格數(shù)及豎直站立次數(shù)無明顯不同。 探索行為結(jié)果顯示,LPS-NS組大鼠與NS-NS組大鼠間點(diǎn)頭次數(shù)無明顯差別。與NS-NS組大鼠相比,NS-KA組大鼠點(diǎn)頭次數(shù)減少。LPS-KA組大鼠比NS-KA組大鼠點(diǎn)頭次數(shù)減少,表明LPS-KA組大鼠比NS-KA組大鼠探索能力降低。 結(jié)論： 1.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代鼠青少年期海人酸所致驚厥易感性增加； 2.孕期炎癥刺激可增加驚厥所致青少年子代鼠海馬神經(jīng)元損傷、惡化神經(jīng)炎癥應(yīng)答并能加劇驚厥所致空間學(xué)習(xí)記憶能力及探索能力損害； 3.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致青少年子代鼠海馬神經(jīng)元損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期活化,但對(duì)海馬區(qū)炎癥因子表達(dá)無影響； 4.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代鼠成年期空間學(xué)習(xí)及記憶能力損害； 綜上所述,生前炎癥刺激可能通過啟動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期活化以致驚厥所致腦損傷加劇。 第二章孕期感染增加氯化鋰-匹羅卡品所致子代成年大鼠驚厥易感性研究目的： 研究孕期感染對(duì)氯化鋰-匹羅卡品所致子代成年大鼠驚厥易感性及相關(guān)腦損傷的影響。研究方法： 1.孕期免疫激活模型的建立 雌性wistar大鼠在孕齡15及16天時(shí),連續(xù)兩天腹腔注射脂多糖(LPS),每次200ug/kg,構(gòu)建孕期免疫激活大鼠模型；對(duì)照組孕鼠腹腔注射相同容積的生理鹽水(NS)。 2.子代年輕成年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型(SE)的建立 選用生后45天(postnatal day45, P45)的雄性子代年輕成年大鼠并隨機(jī)分組。腹腔注射氯化鋰(LiCl,127mg/kg)后,將匹羅卡品(pilocarpine, Pilo)按照36mg/kg給予SE組大鼠腹腔注射,觀察大鼠行為變化。癇性發(fā)作行為學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行(具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見本研究第一章摘要部分)。持續(xù)觀察大鼠行為,記錄發(fā)作的等級(jí)及出現(xiàn)時(shí)間。在SE開始后1小時(shí)給予水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作。僅發(fā)作達(dá)IV或V級(jí)的大鼠納入后續(xù)試驗(yàn)。未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的子代大鼠予以剔除。對(duì)照組成年大鼠腹腔注射相同容積的NS。 這樣,腹腔注射Pilo或NS的子代成年大鼠已經(jīng)被隨機(jī)分為4組,正常對(duì)照組(NS-NS),生前炎癥組(LPS-NS),氯化鋰-匹羅卡品(LiPC)致癇組(NS-LiPC)和“二次打擊”組(LPS-LiPC)。 3.驚厥易感性測(cè)定 LiPC注射后,首次癇性行為發(fā)作的潛伏期作為癇性發(fā)作開始時(shí)間(seizure onset time, SOT)。我們將大鼠前肢局限性陣攣、后肢站立或身體失衡作為首次癇性行為。本研究中,我們用SOT來衡量年輕成年大鼠對(duì)LiPC的驚厥易感性。 4.SE后3天,隨機(jī)選擇各組大鼠,采用尼氏染色觀察大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及損傷情況。 5.P61時(shí),采用曠場(chǎng)試驗(yàn)測(cè)定各組大鼠自發(fā)活動(dòng)水平及探索能力。 6.P68時(shí),采用高架迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組大鼠焦慮水平。 7.P75時(shí),采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),測(cè)定各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力。結(jié)果： 1.孕期暴露于LPS導(dǎo)致子代鼠成年期LiPC所致驚厥易感性增加。 腹腔注射LiPC后,LPS暴露組子代鼠(LPS-LiPC) SOT較NS注射組子代鼠(NS-LiPC) SOT縮短,表明孕期LPS刺激可導(dǎo)致子代鼠成年期LiPC所致驚厥易感性增加。 2. LiPC誘導(dǎo)P45大鼠SE后3天,各組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元損傷情況。 尼氏染色顯示NS-NS組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常,無損傷。LPS-NS組、NS-LiPC組及LPS-LiPC組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)元損傷,表現(xiàn)為CA1及CA3區(qū)尼氏染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,形態(tài)異常。與NS-LiPC組相比,LPS-LiPC組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元損傷加重。尼氏染色結(jié)果表明生前炎癥刺激可產(chǎn)生長(zhǎng)期效應(yīng)：生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后成年期大腦海馬神經(jīng)元損傷,并能加劇驚厥所致海馬神經(jīng)元損傷。 3.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,各組大鼠自發(fā)活動(dòng)水平及探索能力表現(xiàn)情況。 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)自發(fā)活動(dòng)結(jié)果顯示,各組大鼠間水平穿越方格數(shù)及豎直站立次數(shù)無明顯不同。 探索行為結(jié)果顯示,LPS-NS組與NS-NS組之間及NS-LiPC組與NS-NS組之間點(diǎn)頭次數(shù)均無明顯差別。LPS-LiPC組比NS-LiPC組點(diǎn)頭次數(shù)減少,表明LPS-LiPC組大鼠比NS-LiPC組大鼠探索能力降低。 4.各組大鼠在高架迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)情況。 高架迷宮實(shí)驗(yàn)中,用焦慮分?jǐn)?shù)來反映焦慮程度。結(jié)果顯示,LPS-NS組焦慮分?jǐn)?shù)低于NS-NS正常對(duì)照組,表明生前炎癥刺激導(dǎo)致大鼠生后成年期焦慮水平升高。此外,NS-LiPC組焦慮分?jǐn)?shù)高于NS-NS組。LPS-LiPC組與NS-LiPC組大鼠間焦慮分?jǐn)?shù)無明顯差異。 5. Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶情況。 在Morris水迷宮尋找隱藏平臺(tái)的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中,隨著訓(xùn)練進(jìn)展,各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物逃避潛伏期逐漸縮短。與NS-NS組相比,LPS-NS組、NS-LiPC組及LPS-LiPC組大鼠尋找到平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)。與NS-LiPC組相比,LPS-LiPC組大鼠尋找到平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)。 此外,在Morris水迷宮探索試驗(yàn)中,與NS-NS組相比,LPS-NS組、NS-LiPC組及LPS-LiPC組大鼠目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比明顯縮短。NS-LiPC組與LPS-LiPC組目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比無明顯不同。結(jié)論： 1.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代鼠成年期LiPC所致驚厥易感性增高； 2.孕期炎癥刺激可增加驚厥所致成年子代鼠海馬神經(jīng)元損傷； 3.孕期炎癥刺激可加劇驚厥所致空間學(xué)習(xí)及探索能力損害。 4.孕期炎癥刺激可升高子代鼠成年期焦慮水平并導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)及記憶能力損害； 綜上所述,生前炎癥刺激可增加生后成年期驚厥易感性并加劇驚厥所致腦損傷。 第三章新生兒期炎癥增加驚厥所致成年大鼠海馬依賴性記憶損傷 研究目的： 研究新生兒期免疫應(yīng)激能否導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生長(zhǎng)期改變并探索這種變化對(duì)成年期癲癇發(fā)作所致神經(jīng)行為結(jié)果的影響。研究方法： 1.新生兒期免疫激活模型的建立 給予雄性SD大鼠在生后第3天(postnatal day3,P3)及P5,腹腔注射脂多糖(LPS),每次50ug/kg,構(gòu)建新生兒期免疫激活大鼠模型；對(duì)照組新生鼠腹腔注射相同容積的生理鹽水(NS)。 2.免疫熒光法測(cè)定新生兒期LPS刺激對(duì)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響 分別在P5注射LPS或NS后4天(P9)、16天(P21)及40天(P45)時(shí)處死大鼠,取海馬組織。運(yùn)用離子鈣接頭蛋白分子1(Ibal,小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物)免疫熒光染色研究LPS刺激所致小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的時(shí)程變化。 3.在P3注射LPS或NS后,連續(xù)6天給予新生鼠腹腔注射米諾環(huán)素(minocycline)或磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。新生鼠分為3組：SS組(正常對(duì)照組),LS組(新生兒期LPS刺激并PBS處理組)和LM組(新生兒期LPS刺激并米諾環(huán)素處理組)。分別在P9及P21時(shí)處死大鼠,運(yùn)用Ibal免疫熒光染色研究米諾環(huán)素對(duì)LPS所致小膠質(zhì)細(xì)胞變化的抑制效應(yīng)。 4.以下設(shè)計(jì)以研究新生兒期LPS暴露能否對(duì)成年期海人酸(KA)所致神經(jīng)行為結(jié)果產(chǎn)生影響,并探究米諾環(huán)素在其中的作用。新生兒期注射NS或LPS的大鼠PBS或米諾環(huán)素處理后,在P45時(shí)腹腔注射KA,以誘導(dǎo)癲癇發(fā)作。此研究共分4組：正常對(duì)照組(SSS),成年致癇組(SSK),“二次打擊”組(LSK),及“二次打擊”米諾環(huán)素治療組(LMK)。具體方法如下： (1)子代年輕成年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)模型的建立 P45時(shí),將KA按照15mg/kg給予SE組大鼠腹腔注射,觀察大鼠行為變化。癇性發(fā)作行為學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見第一部分。本研究中,我們?nèi)杂冒B性發(fā)作開始時(shí)間(seizure onset time,SOT)來衡量年輕成年大鼠對(duì)KA所致癲癇發(fā)作易感性。在SE開始后2小時(shí)給予大鼠水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作； (2)SE后6h,隨機(jī)選擇各組大鼠,采用實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù),檢測(cè)炎性因子IL-1p及TNFα表達(dá)情況; (3)SE后3天,隨機(jī)選擇各組大鼠,采用1bal染色觀察海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況； (4)從P46至P55,隨機(jī)選擇各組大鼠,運(yùn)用Y-迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠海馬依賴性空間學(xué)習(xí)情況； (5)Y-迷宮實(shí)驗(yàn)后,從P60至P65,運(yùn)用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠海馬依賴性空間學(xué)習(xí)及記憶情況； (6)水迷宮實(shí)驗(yàn)后,在P70,隨機(jī)選擇各組大鼠,運(yùn)用抑制回避實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠海馬依賴性非空間記憶情況。結(jié)果 1.新生兒期暴露于LPS對(duì)成年期KA所致驚厥易感性無影響。 腹腔注射KA后,SSK、LSK及LMK大鼠間SOT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明新生兒期LPS刺激對(duì)成年期KA所致驚厥易感性無影響。 2.新生兒期LPS免疫應(yīng)激導(dǎo)致海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生較長(zhǎng)時(shí)間活化。 Iba1免疫熒光染色顯示,新生兒期LPS暴露組大鼠在P9及P21,海馬區(qū)Iba1陽(yáng)性染色光密度(OD)值高于新生兒期NS注射組大鼠；但是在P45時(shí),兩組大鼠Iba1陽(yáng)性染色OD值無差異。該結(jié)果顯示,新生兒期LPS免疫應(yīng)激導(dǎo)致海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生較長(zhǎng)時(shí)間活化至青少年時(shí)期。 3.米諾環(huán)素抑制LPS所致小膠質(zhì)細(xì)胞活化。 Iba1免疫熒光染色顯示,在P9及P21,LS組海馬區(qū)Ibal陽(yáng)性染色OD值高于LM與SS組；在P9及P21,SS組與LM組Iba1陽(yáng)性染色OD值無差異。 4.SE后6h,各組大鼠炎性因子IL-1βmRNA及TNFαmRNA表達(dá)情況。 RT-PCR定量分析結(jié)果顯示： (1)SSK、LSK及LMK組IL-1β mRNA較SSS組升高；LSK組IL-1βmRNA表達(dá)較SSK組及LMK組升高；SSK與LMK間,IL-1β mRNA表達(dá)水平無差異； (2) SSK、LSK及LMK組TNFα mRNA較SSS組升高；LSK組TNFα mRNA表達(dá)較SSK及LMK組升高；SSK與LMK間,NFa mRNA表達(dá)水平無差異。 5.SE后3天,各組大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。 Ibal免疫熒光染色顯示：SSK、LSK及LMK組Ibal陽(yáng)性染色OD值較SSS組升高；LSK組Ibal陽(yáng)性染色OD值較SSK及LMK組升高；SSK與LMK間,Ibal蛋白表達(dá)水平無差異； 6.從P46至P55,各組大鼠Y-迷宮實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)情況。 Y-迷宮實(shí)驗(yàn)中,自發(fā)交替反應(yīng)率越高表示大鼠學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示SSK、LSK及LMK組自發(fā)交替反應(yīng)率低于SSS組；LSK組自發(fā)交替反應(yīng)率較SSK及LMK組降低,SSK與LMK間自發(fā)交替反應(yīng)率無差別。 7.從P60至P65,各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)情況。 結(jié)果顯示：在Morris水迷宮尋找隱藏平臺(tái)的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中,各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間學(xué)習(xí)能力無明顯差異。 在探索試驗(yàn)中,SSK、LSK及LMK組目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比低于SSS組,LSK組目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比較SSK及LMK組降低,SSK與LMK間目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比無差別。 8.P70時(shí),各組大鼠抑制回避實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)情況。 抑制回避實(shí)驗(yàn)中,暗室逃避潛伏期越長(zhǎng)反映大鼠海馬依賴性非空間記憶力越好。結(jié)果顯示：訓(xùn)練后1小時(shí),LSK組暗室逃避潛伏期較SSS組明顯縮短；SSS、LMK及SSK組之間,暗室逃避潛伏期無明顯差異。訓(xùn)練后24小時(shí),LSK組暗室逃避潛伏期較SSS、SSK及LMK組明顯縮短；與SSS組相比,SSK及LMK組暗室逃避潛伏期縮短；SSK與LMK之間暗室逃避潛伏期無明顯差異。結(jié)論： 1.新生兒期炎癥刺激可導(dǎo)致海馬小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生較長(zhǎng)時(shí)間活化； 2.米諾環(huán)素可抑制LPS所致新生鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化； 3.新生兒期炎癥刺激可能通過長(zhǎng)期啟動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞而加劇成年期癲癇發(fā)作所致神經(jīng)炎癥應(yīng)答反應(yīng)及海馬依賴性行為損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.1;R720.597

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王國(guó)忠;高春錦;余平;鄭自慧;;氧驚厥小鼠腦組織IL-1β和IL-10水平的變化[J];工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病;2011年01期

2 鄭興珍;朱簡(jiǎn);于強(qiáng);王海東;高o，

本文編號(hào)：2102096