本文選題：腎積水 + 腎盂輸尿管連接部梗阻　； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2013年博士論文

【摘要】：背景：先天性腎盂輸尿管連接部梗阻(ureteropelvic junctionobstruction, UPJO)是小兒腎積水最常見的原因，可導致患腎實質受壓變薄、腎功能進行性減退，嚴重影響患兒健康。UPJO的發(fā)病機制目前仍不清楚，但梗阻段的組織學改變已基本明確，表現為平滑肌減少、萎縮、肌層變薄，肌層神經纖維減少及間質內膠原纖維沉積。在這些組織學特點中，平滑肌減少和萎縮為主要改變，因此以平滑肌的發(fā)育為切入點進行研究，有望闡明UPJO的發(fā)病機制。Bmp4是骨形成蛋白家族成員，可通過Smads通路調控相應靶基因的表達，進而調節(jié)多種細胞的分化、增殖和凋亡。Id2是Bmp4靶基因中功能最為重要的一員，在多種細胞中均有表達，其基本生理功能為促進細胞增殖、抑制細胞分化。有研究顯示Bmp4-Id2信號軸在骨骼肌細胞及血管平滑肌細胞的增殖、分化中具有重要調控作用，但其在輸尿管平滑肌形成中的作用及機制尚不明確。在輸尿管芽發(fā)出時，其周圍間充質細胞內可檢測到Bmp4高水平表達。進一步研究發(fā)現Bmp4具有抑制輸尿管芽異位及促進輸尿管芽分支向后腎延伸的雙重作用，體內或體外抑制Bmp4的功能均會引起胚胎期輸尿管平滑肌發(fā)育異常。文獻報道敲除Id2基因的小鼠出現腎積水表型，且腎盂輸尿管連接部的組織學改變與人類UPJO類似。因此研究BMP4-ID2信號軸與人類UPJO的相關性及其在胚胎輸尿管平滑肌發(fā)育過程中的作用，對揭示UPJO的發(fā)生機制具有重要意義。本文的主要研究內容及結果如下： 第一部分BMP4、ID2在先天性腎盂輸尿管連接部梗阻患者腎盂輸尿管連接部組織中的表達 目的：檢測BMP4、ID2在UPJO患者腎盂輸尿管連接部（UPJ）組織的表達，明確BMP4、ID2與先天性UPJO發(fā)生的相關性。 方法： 1.收集UPJO患兒UPJ組織，以腎母細胞瘤患者未受腫瘤侵犯的正常UPJ組織作為對照。 2.通過masson三色法檢測UPJ組織學改變，應用實時熒光定量PCR（Q-PCR）、免疫組化S-P法及western blot檢測BMP4、ID2mRNA及蛋白質的表達。 結果： 1. UPJO患者UPJ組織的主要改變?yōu)椋浩交∈儽�、肌層結構紊亂，部分病例表現為外層環(huán)肌較少、內層縱肌增生；同時伴有間質內膠原纖維沉積。 2. BMP4、ID2蛋白質表達于UPJ組織的粘膜層及平滑肌層，病例組二者的mRNA及蛋白質的表達均降低；提示BMP4、ID2與先天性UPJO的發(fā)生密切相關，UPJO梗阻段平滑肌發(fā)育異�？赡苡膳咛テ贐MP4、ID2表達降低引起。 第二部分先天性腎盂輸尿管連接部梗阻患者BMP4、ID2基因突變分析 目的：檢測UPJO患者BMP4、ID2基因是否存在基因突變，明確其是否與BMP4、ID2表達降低相關。 方法： 1.收集UPJO患者及健康對照兒童靜脈外周血標本，提取基因組DNA；PCR擴增BMP4、ID2基因蛋白質編碼區(qū)。 2.直接測序法檢測PCR產物的堿基序列，應用生物信息學方法預測突變位點的功能。 結果： 1. UPJO患者BMP4基因存在一個有義突變及一個無義突變，即c.485G㧐A (p.R162Q)、c.1167T㧐C (p.Y389Y)；ID2基因存在一個無義突變，即c.108A㧐G (p.L36L)。 2.生物信息學預測c.485G㧐A (p.R162Q)突變可能引起B(yǎng)MP4蛋白的功能異常。 第三部分Id2過表達質粒的構建及其在小鼠成肌細胞C2C12中的表達 目的：構建Id2真核過表達質粒，并檢測其轉染入C2C12細胞后能否表達目的基因。 方法： 1.應用化學合成法合成小鼠Id2基因蛋白質編碼區(qū)，將該序列連接到GV230載體的多克隆位點構建重組質粒，并通過酶切及基因測序鑒定。 2.將Id2/GV230重組質粒轉染C2C12細胞，于轉染后24h、48h檢測轉染效率；再用RT-PCR及western blot檢測轉染后48h Id2mRNA及蛋白質的表達。 結果： 1. Id2/GV230重組質粒在XhoI和KpnI雙酶切下，可得到大小為406bp的目的基因片段；基因測序顯示目的片段的堿基序列與小鼠Id2蛋白質編碼區(qū)相同。 2.轉染24h、48h后的轉染效率分別為(18.8±2.5)%、(19.2±2.7)%，，兩者無明顯差異。轉染組Id2mRNA及蛋白質的表達水平明顯升高。 第四部分Bmp4拮抗及Id2過表達對小鼠胚胎輸尿管平滑肌發(fā)育的影響 目的：明確Bmp4、Id2是否參與胚胎期輸尿管平滑肌的發(fā)育，證實Bmp4對平滑肌的發(fā)育調控作用部分通過Id2介導。 方法： 1.取孕12.5天（E12.5d）BALB/c小鼠胚胎腎臟及輸尿管進行體外培養(yǎng)，分為正常對照組、Noggin拮抗組（Noggin組）及Noggin拮抗、Id2過表達質粒轉染組（Id2組）。 2.在培養(yǎng)的24h后，Noggin組、Id2組各加入Bmp4拮抗劑Noggin5μg（濃度5μg/ml）。3d后換液并在Id2組中加入Id2/GV230過表達質粒（質粒2μg，PolyJet DNA轉染試劑8μl），48h后取培養(yǎng)組織冰凍切片，通過免疫熒光檢測各組標本輸尿管平滑肌肌球蛋白α-SMA的表達。結果： 1.胚胎腎臟體外培養(yǎng)6天后組織狀態(tài)良好。Noggin拮抗組α-SMA的表達明顯降低，提示Bmp4在胚胎輸尿管平滑肌的形成中具有重要作用。 2. Bmp4部分拮抗后，Id2過表達能夠一定程度地恢復胚胎輸尿管α-SMA的表達；提示Id2能夠促進胚胎輸尿管平滑肌細胞的形成，Bmp4對胚胎輸尿管平滑肌發(fā)育的調控部分通過Id2介導。 結論： 1. BMP4-ID2信號軸與先天性UPJO的發(fā)生密切相關，UPJO梗阻段平滑肌發(fā)育異�？赡苡膳咛テ贐MP4、ID2表達降低引起。 2. UPJO患者BMP4基因存在突變位點，即c.485G㧐A (p.R162Q)，這一突變可能是導致BMP4、ID2表達降低的原因之一；但其突變率較低（約1%），因此繼續(xù)闡明可導致基因表達降低的其它因素，如患者UPJ組織中BMP4、ID2是否存在表觀遺傳學的異常等，還需進一步研究。 3.初步證實了Id2具有促進輸尿管平滑肌形成的作用，這一效應可能通過促進已分化平滑肌細胞的增殖來實現；再次證實了Bmp4能促進胚胎期輸尿管平滑肌的發(fā)育，這一功能部分通過Id2介導。
[Abstract]:Background: congenital ureteropelvic junction obstruction (ureteropelvic junctionobstruction, UPJO) is the most common cause of hydronephrosis in children. It can lead to the thinning of the renal parenchyma and the progressive degeneration of renal function. The pathogenesis of the healthy.UPJO in children is still unclear, but the histological changes of the obstructive segment have been basically clear. In these histological features, smooth muscle reduction and atrophy are the main changes in these histological features, and the development of smooth muscle is the breakthrough point. It is expected that the pathogenesis of UPJO,.Bmp4, is a member of the bone morphogenetic protein family, which can be used by Smads. The pathway regulates the expression of the corresponding target gene, and then regulates the differentiation of multiple cells, and the proliferation and apoptosis of.Id2 are the most important members of the Bmp4 target gene, which are expressed in various cells. The basic physiological function is to promote cell proliferation and inhibit cell differentiation. The research shows that the Bmp4-Id2 signal axis is in the skeletal muscle cells and the vascular smooth muscle. The role and mechanism of cell proliferation and differentiation is important, but its role and mechanism in the formation of ureteral smooth muscle is not clear. Bmp4 high level can be detected in the peripheral mesenchyme cells when the ureteral buds are sent out. Further studies have found that Bmp4 can inhibit ectopic ureteral buds and promote the extension of the ureteral buds to the posterior renal extension. Both in vivo and in vitro inhibition of Bmp4 function in both in vivo and in vitro can cause abnormal development of the ureteral smooth muscle in the embryonic stage. It is reported that the hydronephrosis phenotype of the mice with Id2 gene knockout and the histological changes of the ureteropelvic junction are similar to that of human UPJO. Therefore, the correlation of the BMP4-ID2 signal axis and human UPJO and its embryo transfer are studied. The role of urethral smooth muscle development is of great significance in revealing the mechanism of UPJO.
Part one: expression of BMP4 and ID2 in ureteropelvic junction tissues of patients with congenital ureteropelvic junction obstruction
Objective: to detect the expression of BMP4 and ID2 in ureteropelvic junction (UPJ) of UPJO patients, and to clarify the correlation between BMP4 and ID2 and the occurrence of congenital UPJO.
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本文編號：2037545