本文選題：CVB3 + 病毒性心肌炎��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2012年博士論文

【摘要】：柯薩奇病毒的B組(CVB)是侵犯人類心肌引起病毒性心肌炎的首位病原體,其中尤其3型(CVB3)最常見。病毒性心肌炎在兒科臨床是常見的一種傳染病,而成人散發(fā)。感染后可出現(xiàn)發(fā)熱,發(fā)病后可引起突然的、急性心力衰竭,死亡率高。病毒性心肌炎可發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病。CVB3導(dǎo)致病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制主要由病毒直接作用與病毒感染后引起機(jī)體高免疫炎癥性反應(yīng)所致。關(guān)于病毒性心肌炎,目前臨床缺乏有效的預(yù)防手段與特異的治療藥物。因此對(duì)CVB3感染的預(yù)防與治療研究都亟待必行。因而有必要對(duì)CVB3的病原學(xué)與CVB3的致病機(jī)制進(jìn)行深入研究,為開發(fā)有效的預(yù)防與治療藥物提供科學(xué)依據(jù)。因此我們進(jìn)行了如下兩部分工作。 第一部分：初步分析特異性microRNAs(miRNAs)在CVB3病毒性心肌炎發(fā)病中的變化和對(duì)免疫炎性反應(yīng)可能的調(diào)控作用。目的：利用小鼠病毒性心肌炎動(dòng)物模型,來(lái)評(píng)估m(xù)iRNAs在病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：用表達(dá)譜芯片分別檢測(cè)病毒組與對(duì)照組小鼠心臟組織microRNA與mRNA的差異表達(dá)。使用實(shí)時(shí)RT-PCR對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。用miRBase、miRanda與TargetScan3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)差異表達(dá)的microRNA靶基因并取交集。使用Gene Ontology(GO)與Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes (KEGG)軟件檢測(cè)靶基因的功能與生物學(xué)通路,分析miRNAs的調(diào)控作用。結(jié)果：有64個(gè)microRNAs出現(xiàn)變化,其中5個(gè)microRNAs有生物學(xué)統(tǒng)計(jì)意義(p0.05)。分別是miR-146a、miR-23a、miR-21、 miR-374、miR-29a*。這5個(gè)差異表達(dá)的microRNAs參與調(diào)節(jié)體內(nèi)重要的免疫學(xué)通路,如Toll-樣受體(TLR)信號(hào)通路、RIG-I樣受體(RLR)信號(hào)通路、細(xì)胞因子與受體相互作用通路、MAPK信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路,并且經(jīng)實(shí)時(shí)RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些通路的某些信號(hào)蛋白是差異表達(dá)的miRNAs的靶基因。結(jié)論：在CVB3病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制中,病毒感染后,多個(gè)與免疫調(diào)節(jié)通路相關(guān)的特異性miRNAs產(chǎn)生變化,并同時(shí)與心肌炎發(fā)病有關(guān)的炎癥因子的變化相關(guān)。這個(gè)研究有助于深入理解病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)理,為開發(fā)抗CVB3感染與病毒性心肌炎治療藥物提供了新的視角。 第二部分：探索柯薩奇病毒非編碼區(qū)外源microRNA插入的穩(wěn)定性。目的：利用pCMV5/CVB3感染性克隆質(zhì)粒,在其CVB3序列兩側(cè)的5’端與3’端非編碼區(qū)分別插入心肌組織特異的內(nèi)源性microRNAs的互補(bǔ)序列,構(gòu)建含miRNAs互補(bǔ)序列的重組CVB3病毒,觀察其復(fù)制的穩(wěn)定性,為新型CVB3分子減毒疫苗株的研究奠定基礎(chǔ)。方法：利用分子克隆技術(shù)和microRNA的操作技術(shù),將合成單一和三串聯(lián)的miRNAs經(jīng)退火制備成雙鏈miRNAs,分別在CVB3序列的5'UTR和3'UTR選點(diǎn)插入。用重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,觀察其能否恢復(fù)為完整的病毒顆粒,將重組病毒感染TE671細(xì)胞,并提取病毒RNA進(jìn)行測(cè)序鑒定。結(jié)果：5’端插入構(gòu)建的重組病毒質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序確定后,將其轉(zhuǎn)染不含內(nèi)源性miR-133的Hela細(xì)胞后能夠轉(zhuǎn)錄出完整的病毒顆粒,細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變,并且用RT-PCR及WesternBlot鑒定為完整病毒顆粒。感染含有內(nèi)源性miR-133的TE671細(xì)胞不出現(xiàn)病變,證明內(nèi)源性miR-133識(shí)別重組CVB3序列中的miR-133互補(bǔ)鏈并產(chǎn)生對(duì)CVB3復(fù)制及翻譯抑制作用。當(dāng)在Hela細(xì)胞連續(xù)傳3代后,再用重組病毒感染含有miR-133序列的TE671細(xì)胞也出現(xiàn)病變,提取重組病毒RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)miR-133序列被切除,相鄰的病毒序列沒(méi)有發(fā)生改變。做重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到同樣的結(jié)果。因此我們繼續(xù)在3’端尋找構(gòu)建點(diǎn),經(jīng)多步克隆完成構(gòu)建,重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后能夠轉(zhuǎn)錄出完整的病毒顆粒,復(fù)制良好。目前正在用重組病毒感染含有miR-133的TE671細(xì)胞并觀察,同時(shí)進(jìn)行多次傳代觀察其插入穩(wěn)定性。結(jié)論：在CVB3基因組5'UTR的BstBI位點(diǎn)插入外源miR-133互補(bǔ)序列后,由于5'UTR功能區(qū)較多,影響了病毒的復(fù)制,并導(dǎo)致病毒基因組出現(xiàn)不穩(wěn)定,經(jīng)多次傳代后易發(fā)生病毒回復(fù)的情況。病毒在復(fù)制過(guò)程中把外源序列切除的目的是保證其基因組在進(jìn)化上的穩(wěn)定性。因此認(rèn)為在構(gòu)建重組CVB3病毒時(shí),避開5'UTR該位點(diǎn)區(qū)。目前觀察到3'UTR區(qū)插入外源序列無(wú)論從理論上和實(shí)際的結(jié)果上還是存在可行性的。
[Abstract]:CVB3 is the first pathogen of viral myocarditis caused by human cardiac muscle , especially type 3 ( CVB3 ) . It is common in pediatric clinic . Viral myocarditis can develop into dilated cardiomyopathy . The pathogenesis of viral myocarditis can be caused by viral myocarditis . It is necessary to study the pathogenesis of CVB3 . Therefore , it is necessary to study the pathogenesis of CVB3 and provide scientific basis for the development of effective prevention and treatment . Therefore , we have done the following two parts .

Objective : To investigate the role of microRNAs in the pathogenesis of viral myocarditis by using gene Ontology ( GO ) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ( KEGGS ) .

A recombinant CVB3 virus containing miR - 133 was transfected into Hela cells .
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R725.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳新;曾長(zhǎng)英;盧誠(chéng);王文泉;;基于PCR技術(shù)的miRNA定量檢測(cè)方法[J];中國(guó)生物工程雜志;2010年11期

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本文編號(hào)：1928746