本文選題：胎糞吸入綜合征 + 急性肺損傷��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的胎糞吸入綜合征(Meconium aspiration syndrome, MAS)是新生兒期常見呼吸系統(tǒng)危重疾病之一,常見于足月兒和過期產(chǎn)兒。國外流行病學(xué)報道,MAS發(fā)病率為活產(chǎn)新生兒1.2～2.0%,病死率為3-12%。胎兒宮內(nèi)窘迫或產(chǎn)時窒息排出胎糞,胎糞吸入后到達各級氣管、支氣管及肺泡,造成氣道阻塞、炎癥細胞浸潤、炎癥因子大量釋放、肺表面活性物質(zhì)失活,導(dǎo)致急性肺損傷(Acute lung injury,ALI),嚴重者可繼發(fā)肺水腫、肺出血、呼吸衰竭、肺動脈高壓及多臟器功能損害。MAS導(dǎo)致的ALI是一個多因素共同作用的復(fù)雜過程,目前公認,炎癥因子、氧化應(yīng)激損傷、細胞凋亡等參與了ALI的發(fā)生、發(fā)展。細胞外信號通過信號通路向細胞核內(nèi)傳遞,調(diào)控多種細胞因子基因和蛋白的表達。因此,深入研究MAS導(dǎo)致的ALI的信號通路,尋找調(diào)控ALl的關(guān)鍵通路及恰當(dāng)?shù)母深A(yù)藥物,有助于為臨床藥物治療提供新的思路。目前國內(nèi)外多采用成年大鼠、成年豚鼠、新生兔、新生豬等體積較大的動物作為實驗動物,用氣管切開氣管插管的方法建立MAS動物模型,存在一些問題。首先,成年動物組織器官已發(fā)育成熟,無法充分體現(xiàn)胎糞吸入后新生兒各組織器官改變的病理生理過程。其次,氣管切開操作復(fù)雜,不易掌握。第三,氣管切開損傷大,插管后需呼吸機輔助呼吸,可能造成應(yīng)激性肺損傷影響實驗結(jié)果,實驗過程復(fù)雜、建模成功率低,重復(fù)性差。我們選擇日齡14～21天的新生大鼠作為實驗對象,參照小鼠無創(chuàng)直視下經(jīng)口氣管插管的方法,建立新生大鼠MAS模型,同時建立氣管切開氣管插管組作為對照,通過比較建模成功率、肺組織濕干重比、病理評分,評估哪種方法更適宜。我們使用不同濃度的胎糞混懸液,根據(jù)大鼠肺病理損傷結(jié)果,探討建立新生大鼠MAS導(dǎo)致的急性肺損傷模型合適的胎糞濃度。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)在MAS的發(fā)展過程中具有重要的作用,是MAS病理過程中釋放最早、最重要的細胞因子之一,除了自身具有強大的炎癥作用外,還具有啟動出發(fā)多種炎癥因子的作用。胎糞吸入可直接激活包括TNF-a在內(nèi)的多種細胞因子,造成氧化應(yīng)激損傷,促進肺組織內(nèi)多種細胞的凋亡。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPKs)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,通過磷酸化相應(yīng)細胞蛋白,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性,啟動有關(guān)細胞因子和炎性介質(zhì)的基因表達。MAPKs級聯(lián)激活是多種信號通路的中心,接收膜受體轉(zhuǎn)換與傳遞的信號,并將其帶入細胞核內(nèi),在許多細胞增殖相關(guān)信號通路中具有關(guān)鍵作用。MAPK通路主要包括P38通路、JNK通路、ERK1/2通路、ERK5通路。哺乳動物中,ERK1/2通路廣泛存在于各種組織,參與細胞的增殖分化的調(diào)控。多種生長因子受體、營養(yǎng)相關(guān)因子受體等都需要ERK通路的活化來完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。JNK通路是細胞對各種應(yīng)激原誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子,參與細胞應(yīng)激反應(yīng)。p38通路介導(dǎo)炎癥、細胞凋亡等。因此MAPKs信號通路在MAS引起的ALI的發(fā)生、發(fā)展中具有極其重要作用。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要物質(zhì),參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt,亦稱為蛋白激酶B(Protein Kinase B, PKB),是P13K下游主要的效應(yīng)物,通過下游多種通路對靶蛋白進行磷酸化,可激活蛋白的翻譯,增強細胞的生長,具有抗凋亡作用。西地那非是選擇性5型磷酸二酯酶(Phosphodiesterase-5, PDE5)抑制劑,能抑制環(huán)磷酸鳥苷(Cyclic guanosine monophosphate, cGMP)的水解,提高cGMP濃度,從而使選擇性舒張肺血管,降低肺動脈壓力,已列入MAS繼發(fā)肺動脈高壓治療指南。近年研究發(fā)現(xiàn),西地那非同時具有改善氧化應(yīng)激和抑制細胞凋亡的作用,目前已在急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、肺缺血再灌注等方面開展很多相關(guān)研究,但對MAS早期ALI的干預(yù)作用及可能機制國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究。MAS導(dǎo)致ALI是復(fù)雜的變化過程,各種刺激如炎癥介質(zhì)、細胞因子等共同作用,其中多種信號通路相互影響,相互制約。我們通過直視下氣管插管,建立新生大鼠胎糞吸入急性肺損傷模型,以目前公認對ALI有效的地塞米松做對照,通過觀察病理損傷、炎癥因子、細胞凋亡等情況,研究西地那非對MAS導(dǎo)致的ALI的作用,同時探討p38.MAPK.ERK 1/2.MAPK.JNK.MAPK.P13k/Akt信號通路在ALI中的作用,并探討西地那非對信號通路的調(diào)節(jié)作用。本實驗分為三部分：第一部分直視下經(jīng)口氣管插管建立新生大鼠胎糞吸入急性肺損傷模型第二部分西地那非對胎糞吸入誘導(dǎo)新生大鼠急性肺損傷保護作用的研究第三部分胎糞吸入誘導(dǎo)新生大鼠急性肺損傷信號通路及西地那非作用的研究研究方法第一部分48只健康雄性新生Wistar大鼠,日齡14～21天,隨機分為氣管切開組(A組)18只、直視下氣管插管組(B組)24只、正常對照組(C組)6只；B組分為生理鹽水對照組(BN組)、低濃度胎糞組(BL組)、中濃度胎糞組(BM組)、高濃度胎糞組(BH組),每組6只。A、B組大鼠苯巴比妥鈉腹腔麻醉,A組氣管切開,插管后呼吸機輔助呼吸；B組直視下經(jīng)口氣管插管,1分鐘拔管,自主呼吸。胎糞劑量均為2ml/mg,胎糞濃度:A組40mg/ml,BL組30mg/ml,BM組60mg/ml,BH組90mg/ml,BN組氣管內(nèi)注入生理鹽水2m1/kg。氣管內(nèi)注入后6小時觀察各組建模成功率,麻醉后處死,取肺組織HE染色觀察病理評分及測定濕/干重比。第二部分24只新生健康雄性western大鼠,日齡14～21天,隨機分為生理鹽水對照組(C組)、胎糞吸入組(M組)、地塞米松組(D組)、西地那非組(S組),直視下氣管插管,氣管內(nèi)注液2ml/kg,C組注入生理鹽水,其余三組注入胎糞,濃度為60mg/L。氣管內(nèi)注液后30分鐘插胃管,胃管內(nèi)注液2ml/kg, C組、M組注入生理鹽水,S組注入西地那25mg/kg、D組注入地塞米松1mg/kg。6小時后E LISA法檢測血清TNF-a、cAMP、cGMP含量；取肺組織HE染色病理評分；檢測MPO、SOD活性、MDA、NO含量；TUNEL法檢測細胞凋亡；免疫組化法及Western blot檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達；qRT-PCR檢測]NF-a、Bcl-2、Bax基因的表達。第三部分48新生健康雄性western大鼠,日齡14～21天,隨機分為8組,生理鹽水對照組(C組)、胎糞吸入組(M組)、西地那非組(S組),ERK抑制劑組(PD組)、P38抑制劑組(SB組)、JNK抑制劑組(SP組)、PI3K抑制劑組(W組),因各組抑制劑均用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解,故設(shè)立溶劑對照組DMSO組(D組)。各組予腹腔注射,劑量5ml/kg, C組、M組、S組為磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution, PBS);其余組用PBS稀釋試劑至相應(yīng)濃度。SB組注射SB203580,劑量1mg/kg; PD組注射PD95809,劑量10mg/kg;SP組注射SP600125,劑量6mg/kg; W組注射VVortmannin,劑量1mg/kg; D組注射DMSO:劑量50mg/kg。各組抑制劑劑量見參考文獻,并經(jīng)預(yù)實驗。腹腔注射后1小時氣管插管,C組注入生理鹽水,其余組注入濃度為6Omg/ml胎糞混懸液,均為2ml/kg。氣管內(nèi)注液后30分鐘插胃管,S組注入西地那非25mg/kg (生理鹽水稀釋濃度為12.5mg/ml),其余組注入生理鹽水,均為2ml/kg。為防止吸氧影響實驗結(jié)果,實驗過程中未予吸氧。6小時后取肺組織HE染色觀察病理結(jié)果,ELISA法檢測血清TNF-a濃度,免疫組化法及Western blot檢測p-P38、p-JNK、 p-ERK1/2及p-Akt蛋白的表達。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析,計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準差(x±s)表示,所有數(shù)據(jù)均進行方差齊性檢驗,組間均數(shù)比較用單因素方差分析(One-Way ANOWA),其后進行兩兩比較,采用LSD檢驗；分類資料進行卡方檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果第一部分1建模成功率A組18只大鼠中,3只(3/18)成活到氣管插管后6小時,建模成功率16.67%。B組22只(22/24)建模成功,成功率91.67%。BH組死亡2只。兩組建模成功率比較X=24.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。2肺組織濕/干重比各組大鼠肺組織濕/干重比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.48,P0.01)。與C組相比,BN組略高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；然后由低至高依次為BL組、BM組、A組,BH組,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；BH組最高,但與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3病理結(jié)果各組大鼠肺組織病理評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=51.31,P0.01)。C組最低,然后是BN組,但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；BL組、BM組均高于BN組(P0.05),BM組高于BL組(P0.01),低于BH組及A組(P0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；A組最高,但與BH組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第二部分1 病理評分各組間病理評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.46,P0.01)。M組最高,高于D組、S組(P0.05),C組(P0.01),D組、S組高于C組(P0.01),D、S兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2氧化應(yīng)激及炎癥因子M組MPO、NO、MDA濃度最高,高于D組、S組、C組(P0.01),D組、S組高于C組(P0.01)。M組SOD濃度最低,低于C組、D組、S組(P0.01),C組低于D組、S組(P0.01);D、S兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。TNF-a濃度及基因：M組最高,高于C組、D組、S組(P0.05),D組、S組高于C組(P0.01)。3細胞凋亡M組凋亡指數(shù)(TU-NEL法)、Bax蛋白和基因的表達最高,高于C組、D組、S組(P0.01),D組、S組高于C組(P0.01)；C組Bcl-2/ax蛋白和基因、Bcl-2蛋白和基因的表達最低,低于M組、D組、S組(P0.01),M組低于D組、S組(P0.01)；D、S兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4血清cAMP？cGMP濃度D組cAMP最高,高于S組、M組、C組(P0.01),S組高于M組(P0.05)、C組(P0.01),M組高于C組(P0.05)；S組cGMP最高,D組高于M組及C組(P0.01),M組、C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第三部分1 病理評分SB組、SP組和S組炎癥表現(xiàn)較輕,M組、D組、W組及PD組炎癥表現(xiàn)較重。各組間病理評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.23,P0.01)。SB組、SP組和S組較C組升高(P0.01),較M組降低(P0.01),三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；PD組、W組和D組,較C組升高(P0.01),與M組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。由此可見,給予P38、JNK抑制劑及西地那非后病理評分下降,而給予ERK1/2、PI3K抑制劑后病理損傷無減輕。2血清TNF-a濃度檢測各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.87,P0.01)。SB組、SP組、S組較C組升高(P0.01),較M組降低(P0.01),三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；PD組和W組較M組升高(P0.05),兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。由此可見,給予P38、JNK抑制劑及西地那非后血清TNF-a濃度下降,而給予ERK1/2、P13K抑制劑后血清TNF-α升高。3肺組織中p-P38、p-ERK1/2、p-JNK及p-Akt蛋白的表達3.1 p-P38蛋白的表達免疫組化法檢測顯示,胎糞刺激后M組可見p-P38陽性細胞增多,尤其在浸潤的中性粒細胞中多見。給予P38抑制劑及西地那非后,均可見p-P38陽性細胞減少。Western blot檢測顯示,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=48.28,P0.01)。SB組和S組較C組升高(P0.01),較M組、D組降低(P0.01),SB組和S組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3.2 p-ERK1/2蛋白的表達正常對照組可見少量陽性細胞,胎糞刺激后,M組、D組呈陽性表達,主要為中性粒細胞、血管內(nèi)皮細胞等,在細胞漿及細胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒沉積。ERK1/2抑制劑干預(yù)后,p-ERK1/2蛋白表達明顯減少；西地那非干預(yù)后,p-ERK1/2蛋白呈強陽性表達。Western blot檢測顯示,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=124.28,p0.01)。PD組與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義p0.05),低于M組、D組(p0.01)；S組高于M組及D組(p0.05)3.3 p-JNK蛋白的表達免疫組化檢測顯示,西地那非及JNK抑制劑干預(yù)后,肺組織內(nèi)p-JNK表達很弱,與C組相似,M組、D組可見陽性表達,表現(xiàn)為細胞漿內(nèi)及部分細胞核內(nèi)棕黃色。Western blot檢測顯示,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=119.96,p0.01)。C組、SP組、S組肺組織p-JNK表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),均低于M組、D組 (p0.01)。3.4 p-Akt蛋白的表達免疫組化結(jié)果顯示,C組及P13K抑制劑作用后新生大鼠肺組織可見弱陽性表達,W組、D組呈陽性表達,給予西地那非后S組可見陽性表達明顯,細胞內(nèi)見棕黃色顆粒。Western blot檢測顯示,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=57.26,p0.01)。C組和W組最低；S組高于M組、D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義p0.01)。研究結(jié)論1 傳統(tǒng)的氣管切開氣管插管方法對新生大鼠組織損傷大,操作復(fù)雜,需要小動物呼吸機輔助呼吸,建模成功率低,并可導(dǎo)致應(yīng)激性肺損傷,影響實驗結(jié)果。我們通過直視下經(jīng)口氣管插管建立新生大鼠胎糞吸入模型,建模成功率高,無應(yīng)激性肺損傷。同時確定濃度為60mg/ml的胎糞混懸液可導(dǎo)致新生大鼠肺組織典型而廣泛的病理改變。2炎癥因子、氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡參與了胎糞吸入誘導(dǎo)新生大鼠急性肺損傷的發(fā)病機制；西地那非可抑制炎癥因子的表達,減輕氧化應(yīng)激損傷；增加Bcl-2的表達,減少Bax的表達,降低Bcl-2/Bax匕值,從而抑制細胞凋亡,減輕MAS導(dǎo)致的ALI的病理損傷。西地那非可能通過增加cGMP和cAMP的活性發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。3 MAPKs信號通路中的P38、ERK1/2、JNK、及I3K/Akt信號。通路均參與了新生大鼠MAS誘導(dǎo)的ALI的病理過程。P38 MAPK通路和NK MAPK通路可能通過增加炎癥因子TNF-a的表達加重肺組織病理損傷,ERK1/2 MAPK通路和PI3K/Akt通路可減少TNF-a的表達從而減輕病理損傷。西地那非在MAS誘導(dǎo)新生大鼠ALI的動物模型中,可影響信號通路,抑制肺組織p-P38及p-JNK蛋白的表達,增加p-ERK1/2和p-Akt蛋白的表達,具有一定的肺保護作用。創(chuàng)新及意義1 本研究通過直視下經(jīng)口氣管插管建立新生大鼠胎糞吸入模型,建模成功率高,無應(yīng)激性肺損傷。同時確定濃度為60mg/ml的胎糞混懸液適宜用來建立新生大鼠MAS模型。2本研究明確西地那非通過減輕氧化應(yīng)激、減少炎癥因子的表達,抑制細胞凋亡等對MAS誘導(dǎo)新生大鼠ALI具有肺保護作用,為臨床使用西地那非治療ALI提供理論依據(jù)。2本研究明確了MAPKs (P38、JNK、ERK1/2)及PI3K/Akt信號通路均參與了新生大鼠MAS誘導(dǎo)的ALI的病理過程,P38 MAPK通路和.fNK MAPK通路可增加炎癥因子TNF-a的表達加重肺損傷,ERK1/2 MAPK通路和PI3K/Akt通路可減少TNF-a的表達從而減輕病理損傷。西地那非可抑制肺組織p-P38及p-JNK蛋白的表達,增加p-ERK和p-Akt蛋白的表達,具有一定的肺保護作用。選擇性的信號通路抑制劑有望成為臨床治療的新方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R722.1

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