發(fā)布時(shí)間：2018-05-04 05:02

  本文選題：Sonic + hedgehog信號(hào)通路　； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：Sonic Hedgehog(SHH)信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和成年組織穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。經(jīng)典Hh信號(hào)通路是SHH配體與跨膜蛋白受體PTCH(Patched)相結(jié)合,進(jìn)而激活第二個(gè)跨膜蛋白SMO(Smoothened),活化的SMO導(dǎo)致GLI蛋白穩(wěn)定和核內(nèi)積累。GLI 家族包括 GLI1(GLI family zinc finger 1),GLI2(GLI family zinc finger 2)和GLI3(GLI family zinc finger 3)。有充分的證據(jù)表明,SHH信號(hào)通路是胚胎期肺臟形成和發(fā)育過程中重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路,但在出生后的一段時(shí)間和成年動(dòng)物體內(nèi)該信號(hào)通路表達(dá)大為減少。近年來不少研究表明SHH信號(hào)通路在一些肺部疾病中異常激活,如在肺發(fā)育不良中存在SHH信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào),間質(zhì)性肺疾病中發(fā)現(xiàn)有SHH信號(hào)通路的異常激活,在哮喘和慢性阻塞性肺部疾病中觀察到SHH信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào),在肺小細(xì)胞癌和肺非小細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)SHH信號(hào)通路表達(dá)的上調(diào)。但該信號(hào)通路在急性肺損傷的表達(dá)及意義尚不清楚。最新研究表明SHH信號(hào)通路在早期臟器形成和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。SHH信號(hào)通路的突變導(dǎo)致脊柱、肛門、氣管、食管、腎和肢體聯(lián)合綜合征(VACTERL syndrome)。本研究選取腎臟作為代表器官,深入研究SHH信號(hào)在早期臟器發(fā)育中的作用。目前研究表明SHH錯(cuò)義突變和無效突變與"腎發(fā)育不全"和"泌尿生殖系統(tǒng)畸形"相關(guān)聯(lián)。SHH基因敲除鼠腎發(fā)育不全,表現(xiàn)為輸尿管縮短、腎皮質(zhì)及髓質(zhì)體積減少及腎單位減少。然而SHH調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育的具體機(jī)制及其與調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育的其他因子之間的相互作用尚不可知。在本研究中,我們分別探討了 SHH信號(hào)通路在脂多糖(LPS)致急性肺損傷(acute lung injury,ALI)疾病進(jìn)展過程中的表達(dá)變化及意義;以及SHH信號(hào)通路在腎臟發(fā)育過程中的表達(dá)及調(diào)控。第一部分Sonic hedgehog信號(hào)通路:其對內(nèi)毒素性肺損傷小鼠模型的保護(hù)作用目的Sonic hedgehog(SHH)信號(hào)通路在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(ALI)模型中的表達(dá)變化及意義。方法雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為以下4組:對照組、LPS組、LPS-環(huán)巴胺組和環(huán)巴胺組。急性肺損傷模型是通過腹腔注射LPS(5mg/kg)建立,LPS-環(huán)巴胺組是在LPS注入30min后給予SHH信號(hào)通路的抑制劑環(huán)巴胺(50mg/kg),通過HE染色觀察肺組織病理改變,半定量肺組織損傷評(píng)分,測定肺濕干質(zhì)量比值(W/D),PCR檢測肺組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)及SHH、Patched(PTC)及下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1的mRNA表達(dá),同時(shí)Western blot檢測肺組織SHH和GLI1的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果LPS組小鼠的肺組織病理損傷評(píng)分、肺泡隔厚度、W/D、TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照組(P0.05)。LPS組小鼠SHH、PTC、GLI1的mRNA表達(dá)水平在LPS注入后的12h、24h明顯升高,但在6h時(shí)與對照組無明顯差異。與對照組相比,LPS組在6、12、24h的SHH、GLI1蛋白表達(dá)水平均明顯升高,且與時(shí)間呈正相關(guān)。單獨(dú)環(huán)巴胺組對正常小鼠肺組織的病理改變無明顯影響。LPS-環(huán)巴胺組出現(xiàn)SHH、PTC、GLI1的mRNA表達(dá)及SHH、GLI1的蛋白表達(dá)水平降低,同時(shí),肺組織病理損傷評(píng)分、肺泡隔厚度、W/D及TNF-α mRNA表達(dá)均高于LPS組。結(jié)論在LPS所致的ALI模型中存在SHH信號(hào)通路的激活,且SHH信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)可減輕肺損傷,參與肺組織損傷后修復(fù)。第二部分小鼠體外培養(yǎng)胚腎組織中SHH蛋白表達(dá)及其與Fgf8關(guān)系的研究目的探討Sonic hedgehog(SHH)蛋白在小鼠體外原代培養(yǎng)胚腎組織中的表達(dá)及與成纖維生長因子8(Fibroblast growth factor,Fgf8)的關(guān)系。方法檢測胚齡E11.5至E14.5小鼠腎臟組織中SHH及Fgf8表達(dá)水平,體外培養(yǎng)小鼠胚腎組織,分別加入外源性SHH蛋白以及SHH信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺,分為正常對照組、SHH組和SHH+環(huán)巴胺組。通過組織染色和免疫熒光檢測小鼠原代胚腎組織中輸尿管芽發(fā)育及腎單位數(shù)目以評(píng)估腎臟發(fā)育水平。Real-time PCR法檢測SHH及FGF8基因在不同階段胚腎組織中的表達(dá)差異。Real-time PCR及Western blot方法分析三個(gè)不同處理組胚腎組織中Fgf8的分布和表達(dá)。結(jié)果在不同的時(shí)間段,小鼠原代胚腎組織中SHH及Fgf8mRNA表達(dá)水平均呈時(shí)間依賴性增高。外源性SHH蛋白通過促進(jìn)輸尿管芽發(fā)育及增加腎單位數(shù)目促進(jìn)腎臟發(fā)育。與正常對照組比較,SHH組中Fgf8mRNA及蛋白水平顯著降低。抑制SHH信號(hào)通路后,Fgf8表達(dá)恢復(fù)至正常水平。結(jié)論SHH通過Fgf8途徑促進(jìn)輸尿管芽發(fā)育及增加腎單位數(shù)目,參與腎臟發(fā)育過程,為進(jìn)一步探討SHH和Fgf8在腎臟發(fā)育及先天性腎臟疾病中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:The Sonic Hedgehog (SHH) signaling pathway plays a key role in the development of embryo and the homeostasis of adult tissues. The classical Hh signaling pathway is the combination of the SHH ligand with the transmembrane protein receptor PTCH (Patched) and the activation of the second transmembrane protein SMO (Smoothened). The activated SMO leads to the stabilization of the GLI protein and the accumulation of the nuclear.GLI family. Inger 1), GLI2 (GLI family zinc finger 2) and GLI3 (GLI family zinc finger 3). There is sufficient evidence that the SHH signal pathway is an important signal transduction pathway in the formation and development of the embryonic lung, but the expression of the signal pathway is greatly reduced in a period of time after birth and in adult animals. Signal pathways are abnormal activation in some pulmonary diseases, such as the up regulation of SHH signaling pathway in lung dysplasia, abnormal activation of SHH signaling pathway in interstitial lung disease, and the expression of SHH signaling in asthma and chronic obstructive pulmonary diseases, and in small and small cell lung cancer and lung cancer. The expression and significance of the SHH signaling pathway in acute lung injury is not clear. The latest research shows that the SHH signaling pathway plays an important role in the early organ formation and development of.SHH signaling pathways leading to the spinal, anus, trachea, feeding tube, kidney and limb joint syndrome (VACTERL syndrome). In this study, the role of the kidneys as the representative organ is to study the role of SHH signal in the early organ development. The present study shows that the SHH missense mutation and the invalid mutation are associated with the "renal dysplasia" and the "genitourinary system malformation" in the.SHH knockout rats, showing the ureter shortening, the decrease of the renal cortex and medulla volume and the kidney. However, the specific mechanism of SHH regulation of kidney development and its interaction with other factors regulating renal development are unknown. In this study, we explored the changes and significance of SHH signaling pathway in the progression of acute lung injury (acute lung injury, ALI) disease induced by lipopolysaccharide (LPS); and SHH Expression and regulation of signal pathway in the process of renal development. Part 1: Sonic hedgehog signaling pathway: its protective effect on mice with endotoxic lung injury; the expression and significance of Sonic hedgehog (SHH) signaling pathway in the model of acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS) in mice. Methods male Balb/c mice The machine was divided into 4 groups: the control group, the LPS group, the LPS- cyclic amine group and the cyclic amine group. The acute lung injury model was established by intraperitoneal injection of LPS (5mg/kg), and the LPS- cyclic amine group was the inhibitor of the SHH signaling pathway after LPS injection 30min (50mg/kg). The pathological changes of the lung tissue were observed through HE staining, and the semiquantitative lung tissue injury score was measured. Lung wet dry mass ratio (W/D), PCR detection of lung tissue tumor necrosis factor alpha (TNF- alpha), SHH, Patched (PTC) and downstream transcription factor GLI1 mRNA expression, and Western blot detection of lung tissue SHH and GLI1 protein expression. The mRNA expression level of SHH, PTC, GLI1 in the normal control group (P0.05) group.LPS was significantly higher than that of the control group after LPS injection, but there was no significant difference between the control group and the control group. Pathological changes did not significantly affect the expression of SHH, PTC, GLI1, mRNA and SHH, and the level of protein expression in GLI1 was decreased in the.LPS- cyclic amine group. At the same time, the pathological damage score of the lung tissue, the thickness of the alveolar septum, the expression of W/D and TNF- alpha mRNA were higher than that in the LPS group. The expression of SHH protein and the relationship between the SHH protein and Fgf8 in the embryo and kidney tissue of the mice in vitro were studied to investigate the expression of Sonic hedgehog (SHH) protein in the primary cultured embryonic kidney tissue in vitro and the relationship with the fibroblast growth factor 8 (Fibroblast growth factor, Fgf8). The expression of SHH and Fgf8 in the kidney tissues of E11.5 to E14.5 mice was detected by the method. The mouse embryo and kidney tissue was cultured in vitro, and the exogenous SHH protein and the SHH signaling pathway inhibitor, cyclic diamine, were divided into normal control group, SHH group and SHH+ cyclic amine group. The ureteral buds in the renal tissue of mice were detected by tissue staining and immunofluorescence. Development and renal unit number to evaluate the expression of SHH and FGF8 gene in different stages of embryo and kidney tissue by.Real-time PCR method. The distribution and expression of Fgf8 in three different treated groups of embryo and kidney were analyzed by.Real-time PCR and Western blot method. Results in different time periods, SHH and Fgf in mouse primary embryo kidney tissue The expression level of 8mRNA increased in time dependent. Exogenous SHH protein promoted the development of kidney by promoting the development of ureter buds and increasing the number of renal units. Compared with the normal control group, the level of Fgf8mRNA and protein in the SHH group decreased significantly. After the inhibition of the SHH signaling pathway, the expression of Fgf8 was restored to the normal level. Conclusion SHH promotes the transfusion through Fgf8 pathway. The development of urethral buds and the increase of the number of renal units involved in the process of renal development, which provide experimental basis for further study of the role of SHH and Fgf8 in renal development and congenital renal diseases.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R726.9;R725.6

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本文編號(hào)：1841694