本文選題：苯丙酮尿癥 + 苯丙氨酸羥化酶��； 參考：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：苯丙酮尿癥(Phenylketonuria,PKU,MIM#261600)是新生兒最常見的氨基酸代謝障礙性疾病,屬于常染色體隱性遺傳,主要由于苯丙氨酸羥化酶基因(phenylalanine hydroxylase gene,PAH,612349)突變導(dǎo)致苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)活性下降或缺乏,導(dǎo)致血中苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)濃度增高并在神經(jīng)系統(tǒng)和血液中蓄積。未經(jīng)治療的PKU主要表現(xiàn)為智力低下,癲癇抽搐等不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。高苯丙氨酸血癥(Hyperphenylalaninemia,HPA)是一種遺傳異質(zhì)性疾病,包括苯丙氨酸羥化酶缺乏癥和其輔酶四氫生物蝶呤(tetrahydro biopterin,BH4)缺乏癥(tetrahydro biopterin deficiency,BH4D),二者的病因及治療方式完全不同,因此準(zhǔn)確診斷PKU對患兒具有重要意義。PAH基因定位于染色體12q22~q24.1區(qū)域,由13個外顯子組成,編碼區(qū)全長90kb,編碼含有452個氨基酸的單體蛋白。以Sanger測序為基礎(chǔ)的基因診斷是疾病診斷和鑒別診斷的金標(biāo)準(zhǔn),在PKU患兒的篩查、診斷以及家系的產(chǎn)前診斷中具有重要意義。PAH基因突變分布特點(diǎn)具有明顯的地域、種族遺傳異質(zhì)性。研究不同地域、種族的PAH基因突變譜為該地區(qū)、民族建立快速高效的PKU基因診斷、遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷體系提供重要依據(jù)。PKU為可治性遺傳病,低苯丙氨酸飲食是目前主要的治療方法,早期治療可使90%以上患兒達(dá)到正常智力發(fā)育水平。但是治療費(fèi)用昂貴和療效的不穩(wěn)定以及治療依從性差等使一些患兒仍受到疾病影響,產(chǎn)前診斷是預(yù)防PKU患兒出生的主要手段。由于pah基因只在肝臟中表達(dá),因此不能通過檢測羊水中pah酶活性進(jìn)行產(chǎn)前診斷,只能通過dna序列分析的方法對胎兒進(jìn)行基因型檢測,間接推斷胎兒表型。中國pku患者pah基因突變具有熱點(diǎn)突變且60%以上為點(diǎn)突變,熒光pcr熔解曲線技術(shù)可快速有效地檢測基因突變。為建立熒光pcr快速診斷pku技術(shù)平臺,首先必須了解中國pku患者pah基因突變的特征,篩選出pah基因的高頻突變熱點(diǎn),依據(jù)突變熱點(diǎn)設(shè)計探針獲得更高的診斷率。我們針對中國人群pah基因的突變特點(diǎn),利用實(shí)時熒光定量pcr平臺,將熒光pcr熔解曲線技術(shù)應(yīng)用于pku基因診斷,建立的檢測體系具有快速、高效、高通量、低成本等優(yōu)點(diǎn),在pku的基因診斷和群體篩查中具有重要的應(yīng)用價值。材料與方法1苯丙酮尿癥家系收集2008年1月~2014年6月來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳咨詢門診、鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院新生兒篩查中心、鄭州市婦幼保健院新生兒篩查中心的655個無親緣關(guān)系的中國北方漢族pku家系為研究對象。所有患兒均通過bh4負(fù)荷試驗和尿蝶呤分析并結(jié)合臨床癥狀排除了四氫生物喋呤缺乏癥。對pah基因診斷明確的112個家系中118個胎兒(5個家系進(jìn)行了兩次產(chǎn)前診斷,1個家系中為雙胎妊娠)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。2pah基因sanger測序設(shè)計pah基因13個外顯子、外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)、部分啟動子區(qū)域共13對引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增,pcr產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向sanger測序,尋找基因突變位點(diǎn)。所有序列變異位點(diǎn)均針對該位點(diǎn)檢測患者父母的dna序列。3mlpa分析經(jīng)sanger測序后未檢測到或僅檢測到1個突變等位基因的患者,采用多重連接依賴式探針擴(kuò)增(multiplesligation-dependentprobeamplification,mlpa)進(jìn)行pah基因拷貝數(shù)變異的分析。4熒光pcr熔解曲線采用熒光pcr熔解曲線技術(shù)對常見的27種pah基因突變進(jìn)行檢測。5str分析選擇pah基因3個str位點(diǎn)pah-str、pah-26、pah-32,上游引物5’端均采用熒光素fam進(jìn)行標(biāo)記。pcr擴(kuò)增后取pcr產(chǎn)物5μl變性后直接上機(jī)進(jìn)行毛細(xì)管電泳片段分析。6突變命名和驗證新序列變異通過檢索pubmed,thehumangenemutationdatabase(hgmd?)來初步確定為新發(fā)現(xiàn)的序列變異,并查詢千人數(shù)據(jù)庫、dbsnp數(shù)據(jù)庫及hapmap數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步排除是snp。新突變的命名參照國際基因變異命名體制http://www.hgvs.org/mutnomen提供的命名法來命名。7新序列變異的生物信息學(xué)分析采用clustalw分析軟件對人類和其他種屬的pah氨基酸序列進(jìn)行了同源序列比較,并對錯義突變的功能進(jìn)行proveanprediction和polymorphismphenotyping(polyphen-2)分析。8胎兒產(chǎn)前診斷對112個家系中的118個胎兒采用pah基因突變分析聯(lián)合str方法進(jìn)行診斷,并同時進(jìn)行家系親緣關(guān)系鑒定以保證連鎖分析的準(zhǔn)確性。9胎兒隨訪對患胎流產(chǎn)組織進(jìn)行pah基因突變分析驗證,繼續(xù)妊娠胎兒出生后采集足跟血采用guthrie細(xì)菌抑制法進(jìn)行新生兒pku篩查。結(jié)果1pah基因突變在患者中的分布在655個pku家系的1310個pah等位基因中共檢測到1266個突變等位基因,檢出率為96.64%。613例患者攜帶雙等位基因突變,40例患者攜帶單等位基因雜合突變,2例患者未檢測到等位基因突變;534例患者攜帶復(fù)合雜合突變,63例患者攜帶純合突變,40例患者攜帶單雜合突變,16例患者攜帶3個突變,2例患者未檢測到突變;對已收集的父母標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)突變位點(diǎn)檢測,在2個家系中發(fā)現(xiàn)先證者攜帶新生突變,親緣關(guān)系鑒定證實(shí)為親生,其余家系中所有突變位點(diǎn)均來自雙親。2pah基因突變類型和特點(diǎn)655個pku家系中共發(fā)現(xiàn)175種pah基因突變,突變涉及7種類型,包括錯義突變107種(61.1%)、剪切區(qū)突變34種(19.4%)、無義突變15種(8.6%)、小片段缺失11種(6.3%)、大片段缺失6種(3.4%)、插入突變1種(0.57%)、插入缺失突變1種(0.57%)。1266個被檢出等位基因中以p.r243q(17.70%)突變發(fā)生頻率最高、其它依次為ex6-96ag(8.27%)、p.v399v(6.40%)、p.r53h(4.68%)、p.y356x(4.68%)、p.r241c(4.60%)、p.r413p(4.60%)、p.r111x(4.37%)、c.442-1ga(3.43%),此9種突變占所有突變等位基因的58.73%。175種突變分布于pah基因的1-13外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域,等位基因外顯子發(fā)生頻率最高的是第7外顯子33.33%(423/1269),其次是第11外顯子14.42%(183/1269)、6外顯子13.08%(166/1269)、12外顯子10.87%(138/1269)、3外顯子10.55%(134/1269)、5外顯子4.41%(56/1269)。3mlpa分析采用mlpa方法對僅檢測到1個或未檢測到突變等位基因的53例pku患者進(jìn)行pah基因大片段缺失/重復(fù)分析,13例患者攜帶pah基因大片段缺失。4熒光pcr熔解曲線分析采用熔解曲線法針對苯丙酮尿癥試劑盒中pah基因27種突變的檢出率和準(zhǔn)確率分別為85.6%和98.7%。5pah基因新突變序列變異的生物信息學(xué)分析結(jié)果本研究共發(fā)現(xiàn)39種pah基因新突變,將人類、黑猩猩等不同物種的pah蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析,所發(fā)現(xiàn)pah基因新序列變異位點(diǎn)在各個物種間高度保守。結(jié)合proveanprediction和polyphen-2和物種間保守性分析結(jié)果顯示所有新序列變異為有害突變可能性大。6胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果107個家系中的胎兒采用pah基因突變分析和str連鎖分析方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷,5個家系因先證者已故無法進(jìn)行str連鎖分析,僅采用pah基因突變分析方法診斷。經(jīng)pah基因測序分析118例胎兒中112例獲得明確診斷(94.9%),聯(lián)合3個str位點(diǎn),94個家系(79.7%)能提供100%信息;19個家系(16.1%)只能提供50%的排除性診斷信息,5個家系(4.2%)不能提供診斷信息。118個進(jìn)行產(chǎn)前診斷家系胎兒中,31個胎兒攜帶與先證者相同的pah基因復(fù)合雜合突變;58個胎兒攜帶pah基因單雜合突變,為攜帶者;29個胎兒未攜帶pah基因突變,為正常個體可能性大。7胎兒遺傳咨詢及隨訪31個胎兒攜帶與先證者相同的pah基因突變,告知家屬胎兒出生后為與先證者相同的pku患兒的可能性大,30個患胎家屬選擇終止妊娠,胎兒流產(chǎn)物基因分析結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果一致,另1例患胎父母選擇繼續(xù)妊娠,胎兒出生后phe值為1650μmol/l(27.5mg/dl),為pku患者;87個攜帶者和正常胎兒繼續(xù)妊娠,64個胎兒已出生,出生后新生兒pku篩查結(jié)果正常(120μmol/l),余23個胎兒妊娠中。結(jié)論1.中國北方漢人群pah基因突變構(gòu)成有別與其它種族人群,構(gòu)建中國北方pku患者pah基因突變數(shù)據(jù)庫為基因診斷和產(chǎn)前診斷及群體篩查奠定基礎(chǔ)。2.pah基因突變分析聯(lián)合連鎖分析的基因診斷方法可為pku家系提供快速、準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷。3.39種pah基因新突變的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富了人類pah基因突變數(shù)據(jù)庫。4.熒光pcr熔解曲線法是一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的pah基因診斷方法。
[Abstract]:The gene diagnosis of phenylalaninemia ( PAH ) is one of the most common diseases in the newborn . The gene diagnosis based on the gene of phenylalanine hydroxylase ( PAH , 612349 ) is of great significance in the diagnosis , diagnosis and prenatal diagnosis .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R722.1

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