本文選題：病毒性腹瀉 + 基因型�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：急性胃腸炎引起的腹瀉病仍然是兒童時(shí)期，特別是3歲以內(nèi)嬰幼兒常見的疾病。而病毒性腹瀉在其中占有重要的地位。除輪狀病毒外，諾如病毒、扎如病毒、腸道腺病毒和星狀病毒引起的腹瀉也較為常見。因此研究上述四種病毒型腹瀉的發(fā)病規(guī)律、臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)特點(diǎn)，對(duì)該病診斷和治療以及疫苗研發(fā)都具有重要的意義。本課題通過三部分的研究，初步闡明重慶地區(qū)NoV、SaV、EAdV、AstV四種病毒的分子流行病學(xué)特點(diǎn)、規(guī)律，完善重慶市兒童腹瀉的流行病學(xué)資料，為該病的預(yù)防控制提供科學(xué)資料和依據(jù)。 1.四種病毒的流行病學(xué)研究 方法：收集2011年12月至2012年11月期間重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院門診臨床疑診病毒性腹瀉病患兒大便標(biāo)本560例，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)諾如病毒、扎如病毒、腸道腺病毒和星狀病毒基因組核苷酸片段，測(cè)序基因分型后建立進(jìn)化樹。 結(jié)果：收集的560份大便標(biāo)本，男女比例為1.43:1，患兒年齡從22天到12.5歲。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示諾如病毒陽(yáng)性率為21.25%(119/560)，扎如病毒陽(yáng)性率為2.68%(15/560)，腸道腺病毒陽(yáng)性率為5.17%(29/560)，星狀病毒陽(yáng)性率為1.25%(7/560)�；蚍中脱芯匡@示諾如病毒以GII.42006b為優(yōu)勢(shì)株，但新的變異株GII.4Sydney株也有發(fā)現(xiàn)，其次為GII.61.25%(7/560)，GII.30.71%(4/560)，GII.20.36%(2/560)，GII.70.36%(2/560)，GII.120.54%(3/560)，GII.140.36%(2/560)，GI.10.18%(1/560)，GI.30.54%(3/560)。扎如病毒以GI.1為優(yōu)勢(shì)株，占1.43%（8/560），其后依次為GII.10.54%(3/560),GI.20.18%(1/560),GI.40.18%(1/560),GIV.10.36%(2/560)。腸道腺病毒優(yōu)勢(shì)流行株為G41型，占3.21%（18/560）,此外G310.71%（4/560），G3與G12各一株0.18(1/560)，G70.54%(3/560)，G20.36%(2/560)。星狀病毒優(yōu)勢(shì)株為HastV-1型，占0.71%(4/560)，其后為HastV-40.36%(2/560)，HastV-20.18%(1/560)。本次研究中共發(fā)現(xiàn)8例混合感染患兒。各病毒感染高峰期為秋冬季為主，男女性別無(wú)差異。 結(jié)論：重慶地區(qū)兒童四種病毒性腹瀉中以諾如病毒感染為主，GII.4為優(yōu)勢(shì)株，但新型變異株GII.4Sydney已經(jīng)出現(xiàn)。其次為腸道腺病毒感染，以G41型為主。扎如病毒感染以GI.1為主，星狀病毒以HAstV-1型為主。病毒性腹瀉仍以秋冬季為發(fā)病高峰，男女發(fā)病無(wú)性別差異。 2.諾如病毒的重組分析 方法：在119份諾如病毒陽(yáng)性標(biāo)本中隨機(jī)抽取28份，以RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增病毒ORF1區(qū)衣殼蛋白編碼序列，并測(cè)序確定基因分型。與基于RdRp區(qū)的分型結(jié)果比較，兩次分型結(jié)果不一致的標(biāo)本為可疑重組病毒株。擴(kuò)增包括RdRp區(qū)到VP1區(qū)部分序列的長(zhǎng)片段，測(cè)序后將結(jié)果輸入重組分析軟件Simplot和RDP分析，尋找可能的重組事件及重組位點(diǎn)，排除標(biāo)本混合感染的干擾。 結(jié)果：抽取的28份標(biāo)本中，有兩份標(biāo)本兩次分型結(jié)果不一致。CQ242基于RdRp區(qū)序列分型為GII.3，基于VP1區(qū)序列分型為GII.12；CQ426基于RdRp區(qū)序列分型為GII.4，基于VP1區(qū)序列分型為GII.6。將兩份標(biāo)本進(jìn)行長(zhǎng)片段擴(kuò)增，CQ426測(cè)序失敗，無(wú)法判定。CQ242測(cè)序成功，確定為重組株，重組類型為GII.3/GII.12。 結(jié)論：在重慶地區(qū)諾如病毒感染性腹瀉中，存在病毒重組的情況，重組類型為GII.3/GII.12，屬于基因型間重組。因重組會(huì)導(dǎo)致病毒毒力、感染性、理化性質(zhì)等方面的變化，須密切注意，警惕諾如病毒性腹瀉爆發(fā)流行的可能。 3.諾如病毒衣殼蛋白的生物信息學(xué)分析 方法：從NCBI的Protein數(shù)據(jù)庫(kù)中下載重慶地區(qū)諾如病毒流行株GII.42006b的衣殼蛋白氨基酸序列AGS41450。通過瑞士生物信息學(xué)研究所的專業(yè)蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)(Expert Protein Analysis System，，ExPASy)，分析蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)，二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成，并利用同源建模技術(shù)建立蛋白質(zhì)的三維模型結(jié)果，預(yù)測(cè)該蛋白B細(xì)胞抗原表位。 結(jié)果：諾如病毒GII.42006b衣殼蛋白由540個(gè)aa殘基組成，總分子量58991.5，等電點(diǎn)為5.53，負(fù)電荷殘基數(shù)47，正電荷殘基數(shù)35。蛋白質(zhì)半衰期約30小時(shí)，不穩(wěn)定系數(shù)為45.3，脂肪系數(shù)為78.15，總平均親水性為-0.195，為極弱性親水蛋白。主要的跨膜段為107-124位aa殘基，1-106位置的部分為膜內(nèi)段，125-540為膜外段。同源建模模型顯示531-540位aa殘基突出伸向外部，且抗原性最強(qiáng)。B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果同樣顯示此十位aa殘基正是可能的B細(xì)胞表位位點(diǎn)。531-540位aa對(duì)應(yīng)的核苷酸序列與NoV全序列比對(duì)，定位于全序列的6677-6707位核苷酸上，正好處于衣殼蛋白P區(qū)編碼序列。 結(jié)論：諾如病毒GII.42006b衣殼蛋白VP1的抗原性位點(diǎn)是第531-540位aa組成，對(duì)應(yīng)的核苷酸編碼序列為6677-6707，同源建模蛋白三維結(jié)構(gòu)顯示該段aa突起伸向外部，與電鏡下NoV P區(qū)突起部位吻合。
[Abstract]:Diarrhoea caused by acute gastroenteritis is still a common disease in children , especially within 3 years . Viral diarrhea plays an important role in the pathogenesis of viral diarrhea . In addition to rotavirus , it is very important to study the pathogenesis , clinical manifestation and epidemiology of four kinds of virus diarrhea .

1 . Epidemiological study of four viruses

Methods : 560 patients with viral diarrhea were collected from December 2011 to November 2012 in Chongqing Medical University Affiliated to Chongqing Medical University . Using RT - PCR technique , we detected the nucleotide fragment of virus , ligation , adenovirus and star virus , and established the phylogenetic tree after sequencing .

Results : The positive rate of GII . 42006b was 21.25 % ( 1 / 560 ) , GII . 30.54 % ( 2 / 560 ) , GII . 20.18 % ( 1 / 560 ) , GII . 20.36 % ( 2 / 560 ) , GII . 70.36 % ( 2 / 560 ) , GII . 20.18 % ( 1 / 560 ) , GII . 30.54 % ( 2 / 560 ) , GII . 20.18 % ( 1 / 560 ) , GII . 30.54 % ( 2 / 560 ) , GII . 20.18 % ( 1 / 560 ) , GII .

Conclusion : The infection of GII . 4 is dominant in four kinds of viral diarrhea of children in Chongqing , but the new mutant GII . 4Sydney has appeared . Second , the infection of adenovirus type GII . 4Sydney is the main type of G41 type . The virus infection is mainly in the form of G41 . The virus diarrhea still takes HAstV - 1 type as the main . Viral diarrhea still takes autumn and winter as the onset peak , and there is no sex difference between male and female .

2 . recombination analysis of a virus such as a virus

Methods : 28 samples were randomly extracted from 119 non - viral positive samples , amplified by RT - PCR and sequenced . The results were compared with the typing results based on RdRp region . The samples with different typing results were suspected recombinant virus strains . After sequencing , the fragments of partial sequences of RdRp region to VP1 region were amplified , and the results were input into the recombination analysis software Simplot and RDP analysis to find possible recombination events and recombination sites to exclude the interference of mixed infection .

Results : Of the 28 samples , the results of two typing were inconsistent . CQ242 was classified as GII . 3 based on RdRp region sequence and GII . 12 based on the sequence of VP1 region .
CQ426 is based on the RdRp region sequence and is GII . 4 . Based on the sequence typing of the VP1 region to GII . 6 . Two specimens are subjected to long - fragment amplification , CQ426 sequencing fails , and it cannot be determined . CQ242 sequencing is successful , the recombinant strain is determined as recombinant strain , and the recombinant type is GII . 3 / GII . 12 .

Conclusion : In the case of infectious diarrhea in Chongqing , the recombinant type is GII . 3 / GII . 12 , which belongs to the recombination between genotypes . It is necessary to pay close attention to the possibility of the outbreak of viral diarrhea due to the changes of virus virulence , infectivity and physical and chemical properties .

3 . Bioinformatic Analysis of Nore Virus Capsid Protein

Methods : The amino acid sequence of capsid protein in Chongqing , such as GII . 42006b , was downloaded from its Protein database . By using Expert Protein Analysis System ( ExPASY ) , the composition of protein was analyzed by Expert Protein Analysis System ( ExPASY ) , the structure of secondary structure was analyzed , and three - dimensional model of protein was established by homologous modeling technique to predict the epitope of protein B cell antigen .

Results : The protein was composed of 540 aa residues , the total molecular weight was 58991.5 , the isoelectric point was 5.53 , the negative charge residual base 47 , the positive charge residual base 35 , the total average hydrophilicity was - 0.195 , the non - stability coefficient was 45.3 , the fat coefficient was 78.15 , the total average hydrophilicity was - 0.195 , and it was a very weak hydrophilic protein .

Conclusion : The antigenic sites of the capsid protein VP1 of the virus GII . 42006b are 5377 - 6707 , and the corresponding nucleotide coding sequence is 6677 - 6707 . The three - dimensional structure of the homologous modeling protein shows that the protrusion of the segment aa is extended to the outside , and is in agreement with the NoV P region of the NoV P region under the electron microscope .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R725.1

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本文編號(hào)：1744993