本文選題：先天性巨結(jié)腸癥　切入點：腸神經(jīng)嵴細(xì)胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：【研究目的】先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung’s disease,HSCR)是最常見的腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric nervous system,ENS)發(fā)育障礙性疾病。大多數(shù)觀點認(rèn)為,腸神經(jīng)前體細(xì)胞ENCCs介導(dǎo)的ENS發(fā)育障礙是疾病發(fā)生的內(nèi)在原因。而受眾多轉(zhuǎn)錄因子與生長因子調(diào)控其生物學(xué)行為的ENCCs,其發(fā)育的復(fù)雜性決定了HSCR病因?qū)W的復(fù)雜性及多因素性。導(dǎo)致疾病類型及嚴(yán)重程度的差異由多種遺傳因素及環(huán)境因子共同引起。為了更好地理解該疾病,有必要從多角度多層次全面解析ENS形成過程中ENCCs的生物學(xué)行為影響機(jī)制,從而為HSCR病因及病機(jī)研究作進(jìn)一步探索�！狙芯糠椒ā勘菊n題擬以HSCR為研究對象,采用基因芯片技術(shù)對臨床標(biāo)本的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,經(jīng)過擴(kuò)大樣本人群驗證目的基因差異表達(dá)后從臨床標(biāo)本檢測、腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞實驗、RNA干擾實驗等多層次研究手段,通過分析人體腸道組織PTPRR的表達(dá)模式及分布特點,以及干預(yù)PTPRR基因表達(dá)對神經(jīng)嵴干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,從分子水平、細(xì)胞水平觀察PTPRR基因在ENS發(fā)生中發(fā)揮的重要作用�！狙芯拷Y(jié)果】1.通過基因芯片技術(shù)篩選獲得HSCR相關(guān)的lnc RNA與m RNA表達(dá)譜。總共獲得2個lnc RNA和3個m RNA,其表達(dá)量的差異經(jīng)擴(kuò)大樣本驗證后在病變組織與對照組織中有統(tǒng)計學(xué)意義。生物信息學(xué)分析提示目的基因PTPRR主要參與ERK信號通路可逆的蛋白磷酸化調(diào)節(jié),與神經(jīng)元的增殖分化密切相關(guān)。2.PTPRR m RNA及蛋白表達(dá)水平在HSCR痙攣段顯著降低,免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)PTPRR主要表達(dá)于肌間神經(jīng)叢內(nèi)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與Sox10陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞存在共表達(dá)3.在原代培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞中,PTPRR主要表達(dá)于神經(jīng)前體細(xì)胞胞質(zhì)部位,與Sox10呈共表達(dá),誘導(dǎo)分化后PTPRR蛋白及m RNA表達(dá)水平較未分化的神經(jīng)細(xì)胞顯著降低。4.具有誘導(dǎo)外周神經(jīng)嵴細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化的BMP2及GDNF干預(yù)ENCCs后,球體中TUJ1陽性表達(dá)明顯增多,同時出現(xiàn)明顯的分化形態(tài);而球體中GFAP的陽性表達(dá)明顯減少甚至缺失。具有誘導(dǎo)外周神經(jīng)嵴細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化的NRG1干預(yù)ENCCs,熒光染色見球體中TUJ1陽性表達(dá)顯著減少;而球體中GFAP的陽性表達(dá)明顯增加,同時出現(xiàn)明顯的分化形態(tài)。5.PTPRR在三種細(xì)胞因子干預(yù)后ENCCs中陽性表達(dá)均明顯減少,同時Sox10的陽性表達(dá)率也出現(xiàn)相應(yīng)減少。免疫印跡及RT-q PCR結(jié)果同免疫熒光染色,并且在這三種細(xì)胞因子中以GDNF的干預(yù)作用最顯著。6.將過表達(dá)或下調(diào)PTPRR表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染ENCCs后,下調(diào)組PTPRR m RNA及蛋白表達(dá)量均顯著下降;而過表達(dá)組PTPRR m RNA及蛋白表達(dá)量的均顯著上調(diào),表明成功實施基因干預(yù)技術(shù)。7.Ed U染色及免疫熒光法檢測基因干預(yù)后ENCCs的增殖及分化情況,過表達(dá)組ENCCs中無明顯分化細(xì)胞形態(tài),同時Sox10陽性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量顯著增加,細(xì)胞增殖能力增加;而下調(diào)組ENCCs出現(xiàn)大量分化細(xì)胞,其中以TUJ1陽性表達(dá)的增加更顯著,同時伴隨Sox10陽性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量顯著減少以及細(xì)胞增殖能力的下降。8.在PTPRR基因干預(yù)前提下,通過免疫熒光染色及免疫印跡檢測GDNF誘導(dǎo)磷酸化ERK1/2的激活發(fā)現(xiàn),在PTPRR基因過表達(dá)組,p ERK1/2在細(xì)胞中的陽性熒光染色及蛋白水平均顯著減少,與PTPRR基因下調(diào)組中p ERK1/2的陽性熒光染色及蛋白水平均顯著增加結(jié)果相反,兩組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義�！窘Y(jié)論】PTPRR表達(dá)水平的下降與HSCR疾病的發(fā)病狀態(tài)顯著相關(guān),并且表達(dá)于ENCCs的PTPRR通過負(fù)性調(diào)控ERK1/2的磷酸化,抑制神經(jīng)前體細(xì)胞分化,發(fā)揮維持腸神經(jīng)前體細(xì)胞多能性的功能。本研究為HSCR發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路和潛在治療靶點。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R725.7
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本文編號：1675942