本文選題：先天性巨結(jié)腸癥　切入點：腸神經(jīng)嵴細胞　出處：《第四軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：【研究目的】先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung’s disease,HSCR)是最常見的腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric nervous system,ENS)發(fā)育障礙性疾病。大多數(shù)觀點認為,腸神經(jīng)前體細胞ENCCs介導的ENS發(fā)育障礙是疾病發(fā)生的內(nèi)在原因。而受眾多轉(zhuǎn)錄因子與生長因子調(diào)控其生物學行為的ENCCs,其發(fā)育的復雜性決定了HSCR病因?qū)W的復雜性及多因素性。導致疾病類型及嚴重程度的差異由多種遺傳因素及環(huán)境因子共同引起。為了更好地理解該疾病,有必要從多角度多層次全面解析ENS形成過程中ENCCs的生物學行為影響機制,從而為HSCR病因及病機研究作進一步探索。【研究方法】本課題擬以HSCR為研究對象,采用基因芯片技術(shù)對臨床標本的差異表達基因進行篩選,經(jīng)過擴大樣本人群驗證目的基因差異表達后從臨床標本檢測、腸神經(jīng)嵴干細胞實驗、RNA干擾實驗等多層次研究手段,通過分析人體腸道組織PTPRR的表達模式及分布特點,以及干預PTPRR基因表達對神經(jīng)嵴干細胞生物學行為的影響,從分子水平、細胞水平觀察PTPRR基因在ENS發(fā)生中發(fā)揮的重要作用�！狙芯拷Y(jié)果】1.通過基因芯片技術(shù)篩選獲得HSCR相關(guān)的lnc RNA與m RNA表達譜�？偣搏@得2個lnc RNA和3個m RNA,其表達量的差異經(jīng)擴大樣本驗證后在病變組織與對照組織中有統(tǒng)計學意義。生物信息學分析提示目的基因PTPRR主要參與ERK信號通路可逆的蛋白磷酸化調(diào)節(jié),與神經(jīng)元的增殖分化密切相關(guān)。2.PTPRR m RNA及蛋白表達水平在HSCR痙攣段顯著降低,免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)PTPRR主要表達于肌間神經(jīng)叢內(nèi)的神經(jīng)節(jié)細胞與Sox10陽性的神經(jīng)前體細胞存在共表達3.在原代培養(yǎng)的神經(jīng)前體細胞中,PTPRR主要表達于神經(jīng)前體細胞胞質(zhì)部位,與Sox10呈共表達,誘導分化后PTPRR蛋白及m RNA表達水平較未分化的神經(jīng)細胞顯著降低。4.具有誘導外周神經(jīng)嵴細胞向神經(jīng)元細胞分化的BMP2及GDNF干預ENCCs后,球體中TUJ1陽性表達明顯增多,同時出現(xiàn)明顯的分化形態(tài);而球體中GFAP的陽性表達明顯減少甚至缺失。具有誘導外周神經(jīng)嵴細胞向膠質(zhì)細胞分化的NRG1干預ENCCs,熒光染色見球體中TUJ1陽性表達顯著減少;而球體中GFAP的陽性表達明顯增加,同時出現(xiàn)明顯的分化形態(tài)。5.PTPRR在三種細胞因子干預后ENCCs中陽性表達均明顯減少,同時Sox10的陽性表達率也出現(xiàn)相應減少。免疫印跡及RT-q PCR結(jié)果同免疫熒光染色,并且在這三種細胞因子中以GDNF的干預作用最顯著。6.將過表達或下調(diào)PTPRR表達腺病毒轉(zhuǎn)染ENCCs后,下調(diào)組PTPRR m RNA及蛋白表達量均顯著下降;而過表達組PTPRR m RNA及蛋白表達量的均顯著上調(diào),表明成功實施基因干預技術(shù)。7.Ed U染色及免疫熒光法檢測基因干預后ENCCs的增殖及分化情況,過表達組ENCCs中無明顯分化細胞形態(tài),同時Sox10陽性標記細胞數(shù)量顯著增加,細胞增殖能力增加;而下調(diào)組ENCCs出現(xiàn)大量分化細胞,其中以TUJ1陽性表達的增加更顯著,同時伴隨Sox10陽性標記細胞數(shù)量顯著減少以及細胞增殖能力的下降。8.在PTPRR基因干預前提下,通過免疫熒光染色及免疫印跡檢測GDNF誘導磷酸化ERK1/2的激活發(fā)現(xiàn),在PTPRR基因過表達組,p ERK1/2在細胞中的陽性熒光染色及蛋白水平均顯著減少,與PTPRR基因下調(diào)組中p ERK1/2的陽性熒光染色及蛋白水平均顯著增加結(jié)果相反,兩組差異均具有統(tǒng)計學意義�！窘Y(jié)論】PTPRR表達水平的下降與HSCR疾病的發(fā)病狀態(tài)顯著相關(guān),并且表達于ENCCs的PTPRR通過負性調(diào)控ERK1/2的磷酸化,抑制神經(jīng)前體細胞分化,發(fā)揮維持腸神經(jīng)前體細胞多能性的功能。本研究為HSCR發(fā)病機制的研究提供新的思路和潛在治療靶點。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R725.7
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本文編號：1675942