本文選題：SUMO特異性蛋白酶1　切入點(diǎn)：RNA干擾技術(shù)　出處：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:構(gòu)建SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)RNAi慢病毒載體,建立SENP 1穩(wěn)定低表達(dá)的人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(HEPApi C)細(xì)胞系。探討人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(HEPApi C)高氧暴露后,細(xì)胞內(nèi)SENP1與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。方法:實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分進(jìn)行:第一部分,構(gòu)建LV3-SENP1-RNAi質(zhì)粒,制備慢病毒顆粒并感染HEPApi C細(xì)胞,通過q RT-PCR及Western blot法檢測(cè)SENP1在不同細(xì)胞分組中的表達(dá)情況。第二部分,將前期構(gòu)建的SENP1-RNAi-HEPApi C細(xì)胞系作為研究對(duì)象,以高氧誘導(dǎo)HPAEpi C細(xì)胞損傷模型為基礎(chǔ),按3L/min的速度予以模型組制備好的高純混合氣(含900 ml/L O2和50ml/L CO2),持續(xù)10分鐘。隨機(jī)分組細(xì)胞為6組,即對(duì)照組、空載組、實(shí)驗(yàn)組、高氧組、高氧空載組、高氧實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組:HEPApi C細(xì)胞中直接加入含10%胎牛血清與1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基,然后置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)�？蛰d組:慢病毒空載體穩(wěn)定感染HEPApi C細(xì)胞中加入相同培養(yǎng)基與對(duì)照組同等條件培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組:SENP1-RNAi-HEPApi C穩(wěn)定細(xì)胞系加入相同培養(yǎng)基后與對(duì)照組同等條件培養(yǎng)。高氧組:HEPApi C細(xì)胞中加入相同培養(yǎng)基后依照高氧模型處理方式處理,即以3L/min的速度通入含900ml/L O2和50ml/L CO2高純混合氣10min,隨后與前面三組同等條件培養(yǎng)。高氧空載組:慢病毒空載體穩(wěn)定感染HEPApi C細(xì)胞中加入相同培養(yǎng)基后按照高氧組處理方式處理,隨后同等條件培養(yǎng)。高氧實(shí)驗(yàn)組:SENP1-RNAi-HEPApi C穩(wěn)定細(xì)胞系加入相同培養(yǎng)基后按照高氧組模型處理,后置于相同條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至12h、24h、48h,收集細(xì)胞,檢測(cè)指標(biāo):(1)倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變并照相;(2)各組細(xì)胞培養(yǎng)24h,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;(3)各組細(xì)胞培養(yǎng)24h,免疫熒光檢測(cè)SIRT1轉(zhuǎn)位;(4)各組細(xì)胞培養(yǎng)24h,Western blot檢測(cè)SENP1、SIRT1(胞質(zhì)SIRT1、胞核SIRT1)、P53、AC-P53的表達(dá)。結(jié)果:第一部分,成功構(gòu)建LV3-SENP1-RNAi慢病毒載體質(zhì)粒,包裝得到高滴度病毒顆粒并成功感染HEPApi C細(xì)胞。PCR結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組中SENP1的2-ΔΔCt為0.026、,對(duì)照組SENP1的2-ΔΔCt為0.050,空載組SENP1的2-ΔΔCt為0.057。Western blot結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空載組中SENP1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.161±0.015、0.781±0.046、0.811±0.008。與對(duì)照組及空載組相比,實(shí)驗(yàn)組SENP1在基因及蛋白水平表達(dá)均顯著降低(P均0.05)。第二部分結(jié)果如下:(1)倒置相差顯微鏡下可見對(duì)照組、空載組、實(shí)驗(yàn)組三組細(xì)胞生長(zhǎng)良好,貼壁可,分布均勻,多數(shù)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,培養(yǎng)液中懸浮細(xì)胞少。高氧組細(xì)胞生長(zhǎng)情況差,細(xì)胞間距增大,貼壁不穩(wěn),多數(shù)細(xì)胞形態(tài)變圓,漂浮在培養(yǎng)液中。高氧空載組與高氧組情況類似,細(xì)胞變形,懸浮細(xì)胞多。高氧實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)情況較差,與高氧組及高氧空載組相比,發(fā)生形態(tài)改變的細(xì)胞更少,培養(yǎng)液中懸浮細(xì)胞更少,但與對(duì)照組相比,高氧實(shí)驗(yàn)組懸浮細(xì)胞數(shù)是增加的。(2)流式細(xì)胞凋亡結(jié)果示:通氧24h后,細(xì)胞凋亡率明顯增加,六組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);對(duì)照組細(xì)胞凋亡率低于高氧組,空載組細(xì)胞凋亡率低于高氧空載組;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率低于高氧實(shí)驗(yàn)組,三組分別比較,P0.05,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高氧實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率低于高氧組及高氧空載組,但未達(dá)到對(duì)照組水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);高氧組與高氧空載組相比,P0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)免疫熒光結(jié)果顯示:細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光,SIRT1蛋白呈紅色熒光,融合熒光呈紫色。與對(duì)照組、空載組、實(shí)驗(yàn)組相比,高氧組、高氧空載組、高氧實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)位細(xì)胞數(shù)量明顯增加,六組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=99.34,P=0.0000.05);與對(duì)照組相比,高氧組轉(zhuǎn)位率明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.36,P=0.0000.05);與高氧組相比,高氧實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)位率明顯降低,但未達(dá)到對(duì)照組水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.75,P=0.0000.05)。(4)與對(duì)照組相比,高氧組SENP1、總SIRT1、SIRT1(質(zhì)/核)比值、AC-P53蛋白表達(dá)增加,P53蛋白表達(dá)降低;與高氧組相比,高氧實(shí)驗(yàn)組SENP1、總SIRT1、SIRT1(質(zhì)/核比值)、AC-P53蛋白表達(dá)降低,均未達(dá)到對(duì)照組水平;與實(shí)驗(yàn)組相比,高氧實(shí)驗(yàn)組P53蛋白表達(dá)水平增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建了SENP1基因沉默的HEPApi C細(xì)胞系。SENP1、SIRT1參與了高氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng),高氧誘導(dǎo)SENP1表達(dá)增加,SIRT1轉(zhuǎn)位增加,使細(xì)胞核內(nèi)SIRT1減少,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)SIRT1增加,去乙�；疨53減少,AC-P53增加,細(xì)胞凋亡增加;穩(wěn)定沉默SENP1基因后,SENP1表達(dá)降低,SIRT1轉(zhuǎn)位減少,去乙�；疨53增加,AC-P53降低,細(xì)胞凋亡減少,從相反方向證明了SENP1在高氧導(dǎo)致HEPApi C細(xì)胞損傷中的促進(jìn)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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