本文選題：洛美曲松　切入點(diǎn)：神經(jīng)管畸形　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:大量研究表明,神經(jīng)管畸形(NTDs)20%由遺傳因素造成,80%由非遺傳因素造成,但詳細(xì)機(jī)制尚未完全清楚。葉酸缺乏是導(dǎo)致NTDs發(fā)生重要病因之一,是近年來(lái)NTDs研究的最重要成果。大約50-70%的NTDs可通過(guò)適當(dāng)補(bǔ)充葉酸有效預(yù)防,因此,以葉酸為切入點(diǎn),研究NTDs的具體發(fā)病機(jī)制對(duì)NTDs的防治有著重要的意義。值得注意的是,迄今為止,未見(jiàn)通過(guò)單純飲食控制成功建立葉酸缺乏誘導(dǎo)的NTDs動(dòng)物模型的報(bào)道,我們前期根據(jù)葉酸缺乏是通過(guò)葉酸不同代謝途徑的代謝障礙間接導(dǎo)致NTDs及其他發(fā)育障礙的假設(shè),阻斷葉酸相應(yīng)的葉酸代謝通路,成功制備了二氫葉酸還原酶、核苷酸還原酶、胸苷酸合成酶、甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)代謝途徑障礙NTDs小鼠系列動(dòng)物模型,并證實(shí)以上關(guān)鍵酶所涉及的相關(guān)代謝通路障礙均可獨(dú)立引起NTDs的發(fā)生。為深入探索葉酸缺乏導(dǎo)致NTDs及出生發(fā)育障礙提供了模型基礎(chǔ),通過(guò)不同模型的比較,可進(jìn)一步證實(shí)葉酸不同代謝途徑引起NTDs及出生缺陷的代謝機(jī)理。本文涉及的甘氨酰胺核糖核苷酸甲�；D(zhuǎn)移酶(GARFT)也是葉酸實(shí)現(xiàn)其生物效應(yīng)的相關(guān)代謝通路關(guān)鍵酶之一,抑制其活性造成相關(guān)代謝障礙,是否可以誘發(fā)NTDs及其初步的分子機(jī)制是本文擬解決的科學(xué)問(wèn)題。本科學(xué)問(wèn)題的證實(shí)不僅對(duì)闡明葉酸的不同代謝途徑與NTDs及發(fā)育障礙的關(guān)系有著重要的意義,同時(shí)為在單純嘌呤單核苷酸代謝障礙的條件下進(jìn)一步研究NTDs及發(fā)育障礙的機(jī)制提供了重要模型基礎(chǔ)。該方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。目的:1、采用甘氨酰胺核糖核苷酸甲�；D(zhuǎn)移酶(Glycinamide ribonucleotide formyl transferase,GARFT)特異性抑制劑洛美曲松(Lometrexol,dideazatetrahydrofolic acid,DDATHF)對(duì)懷孕小鼠進(jìn)行干預(yù),誘導(dǎo)出嘌呤代謝異常的小鼠NTDs。2、觀察DDATHF誘導(dǎo)的小鼠NTDs胚胎組織GARFT酶活性及嘌呤代謝的情況。3、研究DDATHF干擾嘌呤從頭代謝對(duì)小鼠NTDs胚胎組織細(xì)胞增殖和凋亡的作用。4、研究DDATHF誘導(dǎo)的GAR-FGAR代謝障礙小鼠胚胎干細(xì)胞增殖和凋亡的作用。方法:將19-21g C57BL/6J孕鼠隨機(jī)分組,實(shí)驗(yàn)組于孕7.5(E7.5)天腹腔DDATHF給藥,生理鹽水為對(duì)照組。孕11.5(E11.5)天,取出胚胎,鏡下觀察胚胎神經(jīng)管及畸形的形態(tài)特征;利用組胚病理學(xué)方法進(jìn)一步觀察胚胎組織結(jié)構(gòu)畸變情況;用GARFT酶活性測(cè)定試劑盒和高效液相色譜法在不同時(shí)間點(diǎn)(0h,6h,24h,48h,96h)測(cè)定胚胎組織的GARFT活性及ATP、GTP、d ATP和d GTP的含量;通過(guò)免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-Blot的方法,分析DDATHF制備的NTDs凋亡及增殖的狀況。CCK-8,流式細(xì)胞法及慧星實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析DDATHF對(duì)小鼠D3胚胎干細(xì)胞增殖和凋亡的作用。結(jié)果:1、DDATHF成功誘導(dǎo)出小鼠NTDs,最佳劑量為45 mg/kg,NTDs發(fā)生率為31.7%,小鼠NTDs主要表現(xiàn)后腦神經(jīng)管未閉,其它畸形主要為顱面畸形和發(fā)育遲緩,HE染色可見(jiàn)神經(jīng)管畸形胎鼠后腦泡未閉合。2、GARFT活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)E7.5腹腔注射DDATHF后,胚胎組織中DDATHF活性約在6小時(shí)降到最低,在注射DDATHF96小時(shí)后,GARFT活性仍然低于正常水平。3、HPLC結(jié)果顯示,DDATHF誘導(dǎo)的NTDs胚胎組織中ATP、GTP、d ATP和d GTP的含量在腹腔注射DDATHF后均逐漸降低,在注射DDATHF 96小時(shí)后其含量仍低于正常水平。4、采用免疫組化方法檢測(cè)Phospho-Histone H3(PH3)和Caspase-3(Casp-3)在胎鼠神經(jīng)管神經(jīng)上皮細(xì)胞的表達(dá)情況情況,PH3在NTDs組胚胎組織細(xì)胞的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,Casp-3在NTDs組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多與對(duì)照組(P0.05)。5、Western-Blot檢測(cè)小鼠胚胎組織中PH3蛋白和Casp-3蛋白的表達(dá)水平,PH3蛋白含量明顯低于對(duì)照組,Casp-3蛋白在NTDs組表達(dá)量明顯升高(P0.05)。6、采用RT-PCR的方法檢測(cè)小鼠胚胎組織中Pcna,Foxg1,Ptch1,Apaf1,Casp-3和Casp-9的表達(dá)量,NTDs胚胎組織中Pcna,Foxg1和Ptch1的表達(dá)量顯著低于正常組,Apaf1,Casp-3和Casp-9的表達(dá)量在NTDs組明顯升高(P0.05)。7、CCK-8、Brdu流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DDATHF抑制D3鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)細(xì)胞增殖(P0.05)。8、Annexin V/PI雙染法、線粒體膜電位法及慧星電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DDATHF誘導(dǎo)ESC細(xì)胞凋亡(P0.05)。結(jié)論:1、成功建立DDATHF致C57BL/6J小鼠胚胎NTDs動(dòng)物模型。2、研究表明了嘌呤代謝異常與NTDs相關(guān),為葉酸缺乏引起NTDs的機(jī)制研究作了重要補(bǔ)充。3、DDATHF可引起胚胎組織細(xì)胞的增殖減少和凋亡增加,神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中的平衡紊亂,可能是DDATHF導(dǎo)致NTDs發(fā)生的機(jī)制之一。4、DDATHF誘導(dǎo)的GAR-FGAR代謝障礙D3鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)增殖抑制,凋亡增加。
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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R748;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 裴麗君,李竹,李松,洪世欣,葉榮偉,陳新,鄭俊池,王太梅,趙秀琴,肖嵐,王麗娜,張伯蘭,劉志欣,周永蘭,姜梅芳,孫霞美,陳海蘭,李敏,楊曉玲,沈泉珍,邵佩云,謝連云;中國(guó)神經(jīng)管畸形高低發(fā)地區(qū)季節(jié)及性別分布特征[J];中華流行病學(xué)雜志;2003年06期

2 楊琴,陳家童,耿朝暉,俞新大,黃熙泰;利用免疫熒光標(biāo)記研究磷酸化組蛋白H3在乳腺癌細(xì)胞中的分布[J];遺傳學(xué)報(bào);2002年06期

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本文編號(hào)：1587839