本文選題：VAP　切入點(diǎn)：機(jī)械通氣新生兒　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎新生兒氣管導(dǎo)管生物膜菌群分析目的氣管導(dǎo)管生物膜是呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。本研究旨在對(duì)機(jī)械通氣新生兒氣管導(dǎo)管生物膜菌群進(jìn)行分析,以探討VAP發(fā)生相關(guān)的生物膜細(xì)菌。方法收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2014年1月31日至2015年1月31日診斷為呼吸窘迫綜合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)和肺炎的機(jī)械通氣48小時(shí)以上的新生兒的氣管導(dǎo)管標(biāo)本。對(duì)氣管導(dǎo)管生物膜細(xì)菌DNA進(jìn)行提取,并擴(kuò)增16s r RNA基因V3-V4區(qū),進(jìn)行Miseq測(cè)序。將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控獲得有效序列,計(jì)算覆蓋度指數(shù)及繪制稀釋曲線來評(píng)價(jià)Miseq測(cè)序深度與覆蓋度。分析并計(jì)算菌群多樣性指數(shù),同時(shí)根據(jù)97%的相似水平將序列劃分為不同的可操作分類單元(operational taxonomy unit,OTU),進(jìn)行OTU分析得到細(xì)菌種屬信息。結(jié)果基于Miseq測(cè)序和生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械通氣新生兒氣管導(dǎo)管生物膜均為多種細(xì)菌共存,且菌群多樣性明顯。不同基礎(chǔ)疾病的患兒氣管導(dǎo)管生物膜菌群多樣性及組成存在明顯差異(P0.05)。Spearman相關(guān)性分析顯示氣管導(dǎo)管生物膜上鏈球菌的檢出可能與VAP的發(fā)生具有相關(guān)性(P0.05)。雖然差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但是導(dǎo)管生物膜鏈球菌的檢出者所需機(jī)械通氣時(shí)間更長(zhǎng),白細(xì)胞水平更低。結(jié)論鏈球菌屬在VAP新生兒氣管導(dǎo)管生物膜中檢出率明顯升高,提示其可能與VAP的發(fā)生具有一定相關(guān)性。第二部分呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎新生兒氣管導(dǎo)管生物膜菌群與咽拭子、導(dǎo)管吸取物菌群關(guān)系研究目的出于對(duì)患兒安全的考慮,無法取得機(jī)械通氣過程中的氣管導(dǎo)管標(biāo)本,使得在機(jī)械通氣過程中特別是懷疑發(fā)生VAP時(shí)的導(dǎo)管生物膜菌群無法獲知,需要尋找其他類型標(biāo)本來代表導(dǎo)管生物膜菌群。方法同時(shí)收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2014年1月31日至2015年1月31日診斷VAP的新生兒氣管導(dǎo)管、咽拭子及導(dǎo)管吸取物標(biāo)本。對(duì)以上三種類型標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌DNA提取,擴(kuò)增16s r RNA基因V3區(qū),進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)。根據(jù)DGGE圖譜以進(jìn)行菌群多樣性及聚類分析。對(duì)DGGE條帶進(jìn)行切割克隆測(cè)序,將序列與Gen Bank比對(duì),獲得細(xì)菌種屬信息。比較三種類型標(biāo)本菌群多樣性及組成特征。結(jié)果合并有VAP的機(jī)械通氣新生兒導(dǎo)管生物膜細(xì)菌多樣性與相應(yīng)的導(dǎo)管吸取物標(biāo)本類似,而與咽拭子標(biāo)本存在明顯差異(P0.05)。導(dǎo)管生物膜、咽拭子及導(dǎo)管吸取物標(biāo)本總體細(xì)菌構(gòu)成存在明顯差異(P0.05)。導(dǎo)管吸取物標(biāo)本葡萄球菌的檢出能很好的預(yù)測(cè)其在導(dǎo)管生物膜的存在,靈敏度為85.7%,特異度為83.3%。咽拭子中假單胞菌屬的檢出對(duì)預(yù)測(cè)其在導(dǎo)管生物膜中的存在有一定的幫助,特別是在早發(fā)VAP患者中靈敏度為60.0%,特異度為100%。結(jié)論雖然不能完全反映出導(dǎo)管生物膜的菌群情況,但是運(yùn)用咽拭子及導(dǎo)管吸取物的細(xì)菌檢測(cè)可以幫助預(yù)測(cè)相應(yīng)導(dǎo)管生物膜細(xì)菌,特別是VAP致病菌如葡萄球菌屬和假單胞菌屬,所以其在VAP的疾病監(jiān)控中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。第三部分導(dǎo)管生物膜鏈球菌的分離鑒定及其對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成影響的體外研究目的進(jìn)一步分離及鑒定導(dǎo)管生物膜臨床鏈球菌,并探討其對(duì)VAP常見致病菌銅綠假單胞菌生物膜形成的影響。方法收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2014年1月31日至2015年1月31日診斷VAP的新生兒氣管導(dǎo)管標(biāo)本。對(duì)氣管導(dǎo)管生物膜進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色及接觸酶試驗(yàn)初步鑒定出鏈球菌,進(jìn)一步提取細(xì)菌DNA進(jìn)行鏈球菌管家基因擴(kuò)增并測(cè)序。將序列結(jié)果與鏈球菌數(shù)據(jù)庫比對(duì),MEGA6繪制進(jìn)化樹了解臨床鏈球菌種屬信息。將其與銅綠假單胞菌PAO1(ATCC BAA-47)進(jìn)行共培養(yǎng)生物膜,并與銅綠假單胞菌PAO1單獨(dú)培養(yǎng)的生物膜對(duì)比,比較生物膜形成情況及銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因las I,las R,rhl,rhl R和藻酸鹽形成關(guān)鍵基因agl D的表達(dá)。結(jié)果在所有導(dǎo)管生物膜標(biāo)本中,分離到一株鏈球菌,經(jīng)過進(jìn)化樹親緣分析鑒定為血鏈球菌。其可促進(jìn)銅綠假單胞菌PAO1生物膜的形成,并可促進(jìn)銅綠假單胞菌PAO1的生長(zhǎng)。臨床血鏈球菌顯著上調(diào)銅綠假單胞菌PAO1群體感應(yīng)las及rhl系統(tǒng)關(guān)鍵基因,及藻酸鹽合成關(guān)鍵基因的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論臨床分離血鏈球菌可促進(jìn)VAP致病菌銅綠假單胞菌生物膜的形成,這可能在VAP的致病中起到一定作用。第四部分導(dǎo)管生物膜鏈球菌臨床分離株及銅綠假單胞菌混合培養(yǎng)生物膜對(duì)人肺上皮細(xì)胞的影響目的探討臨床分離鏈球菌與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)生物膜對(duì)人肺上皮細(xì)胞活性及炎癥因子釋放的影響。方法分別將臨床分離鏈球菌和銅綠假單胞菌PAO1共培養(yǎng)生物膜培養(yǎng)液、銅綠假單胞菌PAO1生物膜培養(yǎng)液及臨床分離鏈球菌生物膜的培養(yǎng)液干預(yù)BEAS-2B肺上皮細(xì)胞(ATCC 9609)。干預(yù)24小時(shí)后,顯微鏡下觀察不同處理組細(xì)胞的變化,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性,Hochest/PI進(jìn)行細(xì)胞凋亡與壞死染色。并在處理1、3、6、9、12和24小時(shí)后分別收集不同生物膜培養(yǎng)液干預(yù)組的細(xì)胞上清液,ELISA檢測(cè)IL-8水平。結(jié)果臨床血鏈球菌與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)生物膜對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的活性損傷明顯小于銅綠假單胞菌單獨(dú)培養(yǎng)生物膜(P0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果說明,干預(yù)3小時(shí)后IL-8達(dá)到最高峰,且共培養(yǎng)組IL-8水平低于銅綠假單胞菌單獨(dú)培養(yǎng)生物膜組(P0.05)。結(jié)論臨床血鏈球菌可能參與調(diào)控宿主對(duì)銅綠假單胞菌生物膜感染的固有免疫反應(yīng)。
[Abstract]:The first part of ventilator-associated pneumonia in the endotracheal tube biofilm flora analysis to endotracheal tube biofilm is ventilator-associated pneumonia (ventilator-associated pneumonia, VAP) an important risk factor. The purpose of this study was to mechanical ventilation for neonatal tracheal catheter biofilm bacteria were analyzed to investigate the occurrence of VAP biofilm bacteria related to children's hospital. Methods from January 31, 2014 to January 31, 2015 affiliated to Medical University Of Chongqing diagnosed respiratory distress syndrome (neonatal respiratory distress syndrome, NRDS) of mechanical ventilation and tracheal catheter were pneumonia 48 hours of newborns. The endotracheal tube biofilm bacterial DNA extraction and R amplification of 16S RNA gene V3-V4 region, Miseq sequencing. The original data will be obtained by sequencing mosaic, quality control effective sequence, calculating coverage index and drawing dilute Release curve to evaluate the Miseq sequencing depth and coverage. The analysis and calculation of the bacterial diversity index, and according to the similarity level of 97% sequence is classified as operational taxonomic units (operational taxonomy unit, different OTU), OTU analysis of bacterial species information. Based on the results of Miseq sequencing and bioinformatics research found mechanical ventilation in neonatal endotracheal tube biofilm were polymicrobial coexistence, and bacterial diversity significantly. Different basic diseases in children with tracheal catheter biofilm bacteria diversity and composition has obvious difference (P0.05).Spearman correlation analysis showed that there is correlation between detection and VAP endotracheal tube biofilm of Streptococcus (P0.05) although the differences did not reach statistical significance (P0.05), but the detection of ductal biofilm Streptococcus required mechanical ventilation longer, lower levels of white blood cells. Conclusion. The detection rate of bacteria was significantly higher in the VAP of neonatal tracheal catheter in biological membranes, suggesting that it may have a certain correlation with the occurrence of VAP. The second part of ventilator-associated pneumonia in neonatal endotracheal tube biofilm bacteria and throat swab, catheter draw object for children with bacteria research group relationship between security considerations, unable to obtain the endotracheal tube specimen machine the process of ventilation, the mechanical ventilation process especially suspected catheter biofilm flora occurred when VAP is not informed, to find other types of samples to represent the catheter biofilm bacteria. Neonatal tracheal catheter method and collected from January 31, 2014 to January 31, 2015 for diagnosis of VAP children's Hospital Affiliated to Medical University Of Chongqing, throat swabs and catheter aspiration specimens for the above three types of specimens for bacterial DNA extraction, 16S amplification of R RNA gene V3 region by denaturing gradient gel electrophoresis (D Enaturing gradient gel electrophoresis, DGGE). According to DGGE patterns for bacterial diversity and cluster analysis. The DGGE strip cutting cloning and sequencing, sequence and Gen Bank comparison, get the species information. Comparison of three types of specimens of flora diversity and composition characteristics. The results with VAP in neonates with mechanical ventilation the catheter biofilm bacteria diversity and corresponding catheter aspiration specimens, and throat swab specimens have obvious difference (P0.05). The catheter biofilm, throat swab and catheter aspiration specimens of bacterial composition has obvious difference (P0.05). The catheter aspiration specimens of Staphylococcus aureus detection can well predict the in the presence of catheter biofilm, the sensitivity was 85.7%, specificity was 83.3%. throat swabs from Pseudomonas detection will help to predict the existence of the catheter in the biofilm, especially in early VAP patients The sensitivity was 60%, specificity was 100%. conclusion although not completely reflect the flora of catheter biofilm, but the use of throat swab and catheter suck bacteria detected can help predict the corresponding catheter biofilm bacteria, especially VAP pathogenic bacteria such as Staphylococcus and Pseudomonas spp., so its application value in disease surveillance in VAP. Objective to study in vitro the third portion of the catheter biofilm of Streptococcus and isolation and identification of Pseudomonas aeruginosa biofilm formation further isolation and identification of clinical catheter biofilm of Streptococcus, and investigate its influence on the formation of common pathogenic bacteria of Pseudomonas aeruginosa biofilm on VAP. Methods a newborn. Samples were collected from January 31, 2014 to January 31, 2015 the catheter diagnosis of VAP children's Hospital Affiliated to Medical University Of Chongqing. The endotracheal tube biofilm were cultured according to the bacteria, Fall morphology, Gram staining and identification of catalase test Streptococcus, further extracting bacterial DNA gene was amplified and sequenced. Streptococcus and Streptococcus results sequence database, MEGA6 phylogenetic tree of Streptococcus species. To understand the clinical information and the Pseudomonas aeruginosa PAO1 (ATCC BAA-47) were co cultured with biofilm that biofilm compared and cultured separately with Pseudomonas aeruginosa PAO1, biofilm formation and Pseudomonas aeruginosa quorum sensing system of key genes Las I, Las R, RHL, R and RHL expression of key genes AGL D alginate formation. Results in all the catheter biofilm samples, isolated strains of Streptococcus through the genetic analysis of the phylogenetic tree, identified as Streptococcus sanguis. It can promote the formation of Pseudomonas aeruginosa biofilm in PAO1, and can promote the growth of Pseudomonas aeruginosa PAO1. Clinical Streptococcus sanguis significantly up-regulated P. The key gene of Pseudomonas PAO1 quorum sensing LAS and RHL system, and the expression of key genes in the synthesis of alginate (P0.05). Conclusion Streptococcus isolated from clinical blood formation can promote VAP pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa biofilm, which may play a role in the pathogenesis of VAP. The fourth part is the introduction of clinical isolates of Streptococcus tube biofilm strains of Pseudomonas aeruginosa and the effect of mixed culture biofilm on human lung epithelial cells objective to investigate the effect of co culture of biofilm on the release of active and inflammatory factors in human lung epithelial cells in clinical isolates of Streptococcus and Pseudomonas aeruginosa respectively. Methods the clinical isolates of Streptococcus pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa biofilm PAO1 co culture medium. The biofilm of Pseudomonas aeruginosa cultured in PAO1 and clinical isolates of Streptococcus biofilm medium intervention BEAS-2B lung epithelial cells (ATCC 9609). After 24 hours of treatment, were observed under the microscope at Changes of cells, CCK-8 cell activity detection, Hochest/PI staining and cell apoptosis and necrosis. In the treatment of 1,3,6,9,12 cell supernatant and 24 hours respectively after collecting different biofilm culture medium in the intervention group, ELISA to detect the level of IL-8. The clinical results of Streptococcus sanguis and Pseudomonas aeruginosa were cultured on BEAS-2B cell membrane damage of biological activity significantly less than that of Pseudomonas aeruginosa biofilm (P0.05).ELISA test results show that, after 3 hours of treatment IL-8 reached the peak, and the co culture group level of IL-8 was lower than that of Pseudomonas aeruginosa biofilm alone group (P0.05). Conclusion the clinical Streptococcus sanguis may be involved in the regulation of the innate immune response of host Pseudomonas aeruginosa biofilm infection.

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R722.135

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本文編號(hào)：1556561