本文關鍵詞： 哮喘 STAT6 ORMDL3 氣道重塑 小鼠　出處：《鄭州大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：支氣管哮喘（bronchial asthma）是兒童時期最常見的慢性呼吸道疾病之一。以氣道高反應、可逆性氣流受限和肺功能降低為主要表現(xiàn)。哮喘的發(fā)病機制非常復雜，是一種免疫、環(huán)境、遺傳等多因素共同介導的疾病。目前其具體的發(fā)病機制尚未明確，其中Th1/Th2亞群比例失衡和功能失衡仍為目前公認的免疫學發(fā)病機制。酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）信號轉(zhuǎn)導通路是胞內(nèi)一條重要信號轉(zhuǎn)導通路，IL-4、IL-13等多種細胞因子及炎癥介質(zhì)可通過該路通介導發(fā)揮生物學作用。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transduction andactivator of transcription, STAT）蛋白家族是一組胞質(zhì)蛋白，經(jīng)過磷酸化后轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，與特定的反應元件結(jié)合，活化靶基因，調(diào)節(jié)相關基因的轉(zhuǎn)錄。STAT6是STAT家族中的一員，是Th2細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，被IL-4、IL-13等細胞因子激活后促使Th2細胞的增殖、分化，導致Th2細胞功能亢進，而Th2細胞功能亢進在哮喘的發(fā)病機制中起到重要作用。血清類黏蛋白1樣蛋白3（orosomucoid1-like3, ORMDL3）基因是2007年發(fā)現(xiàn)的與兒童哮喘的發(fā)生有密切關系的哮喘易感基因[1]。其編碼位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）上由153個氨基酸組成的跨膜蛋白，ORMDL3基因雖為哮喘易感基因，但是其與氣道重塑的關系仍不明了。本研究建立哮喘氣道重塑模型，應用布地奈德混懸液（budesonide,BUD）進行干預治療，觀察氣道重塑改善情況，STAT6及ORMDL3的表達情況，探討二者參與哮喘的可能機制。 目的 建立哮喘小鼠氣道重塑模型，觀察氣道壁厚度、炎癥細胞浸潤、上皮下纖維化情況，檢測肺組織中STAT6mRNA及其蛋白和ORMDL3mRNA的表達情況，以及布地奈德的干預對其表達的影響。 材料和方法 1實驗小鼠分組和哮喘模型制作 SPF級雌性BALB/c小鼠30只，體重20～25g，飼養(yǎng)1周使其適應環(huán)境后，按隨機數(shù)字法分為對照組、哮喘組和干預組，每組10只。應用雞卵清蛋白（OVA）致敏及激發(fā)建立哮喘小鼠模型，干預組在每次激發(fā)前30min應用BUD進行霧化吸入，對照組應用生理鹽水替代OVA溶液。 2肺組織標本的制備 各組小鼠分別在末次激發(fā)結(jié)束后24h內(nèi)，處死，打開胸腔，充分暴露雙肺，將左肺保存于-80℃冰箱中，用于ELISA及RT-PCR檢測；右肺中葉經(jīng)4%甲醛外固定，石蠟包埋，3μm切片，用于蘇木精-伊紅（HE）染色、馬松三染色（Masson）及免疫組化。 3HE染色及Masson染色 切片經(jīng)脫蠟后，分別行HE染色和Masson染色。高倍顯微鏡下觀察氣道結(jié)構(gòu)改變及炎癥細胞浸潤情況，并測定同級別支氣管的管壁厚度。 4免疫組化染色 采用SP法行免疫組織化學染色：脫蠟、脫水、抗原修復、封閉內(nèi)源性過氧化物酶、加一抗、4℃過夜、滴加二抗、顯色、復染、分化、封片等嚴格遵從免疫組織化學染色步驟操作。在顯微鏡高倍鏡（10×40）下觀察、攝片。每個標本隨機擇取5個高倍鏡視野范圍，應用醫(yī)學病理圖像分析系統(tǒng)進行STAT6蛋白測定，結(jié)果用積分光密度(IOD)值表示。 5ELISA法檢測肺組織IL-13水平 將保存于-80℃冰箱的肺組織研磨成勻漿，按照IL-13試劑盒說明檢測各組肺組織勻漿中IL-13水平。 6RT-PCR檢測STAT6mRNA、ORMDL3mRNA表達 取出保存于-80℃冰箱的肺組織（約100mg），提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設計引物并擴增目的基因片段。擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進行分析，目的基因STAT6mRNA、ORMDL3mRNA的表達量以其DNA條帶灰度值和內(nèi)參GAPDH的DNA條帶灰度值的比值計算。 7統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)處理。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(X S)表示，組間樣本均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析，采用LSD-t法進行兩兩比較，兩個因素之間相關性采用pearson相關分析，以=0.05為檢驗水準。 結(jié)果 1各組小鼠病理形態(tài)學改變 在普通光學顯微鏡高倍鏡（10×40）下觀察：對照組氣道壁完整，厚度正常，上皮細胞排列正常，少量炎性細胞。哮喘組氣道結(jié)構(gòu)紊亂，表現(xiàn)為支氣管壁增厚、杯狀細胞化生、粘液分泌增多、膠原纖維沉積，，大量炎性細胞浸潤。干預組氣道結(jié)構(gòu)紊亂情況較哮喘組減輕，炎性細胞較哮喘組減少。根據(jù)單因素方差分析結(jié)果：F=109.43，P0.05，三組小鼠氣道管壁厚度差異有統(tǒng)計學意義，進一步進行兩兩比較，哮喘組氣道壁厚度(160.50±21.38μm)較干預組(84.50±15.45μm)及對照組(48.70±9.84μm)增高，干預組氣道壁厚度較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義。 2各組小鼠免疫組化結(jié)果 三組小鼠肺組織中均有STAT6蛋白表達，其主要分布于上皮細胞及炎癥細胞胞漿中，表現(xiàn)為棕黃色顆粒。根據(jù)單因素方差分析結(jié)果：F=66.118，P0.05，三組間小鼠肺組織STAT6蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義，進一步進行兩兩比較，哮喘組STAT6蛋白的表達水平(123.40±19.60)較干預組(80.00±10.43)及對照組(49.30±11.59)增高，干預組較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義。 3各組小鼠肺組織IL-13水平 三組小鼠肺組織中均有IL-13表達。根據(jù)單因素方差分析結(jié)果：F=416.988，P0.05，三組間小鼠肺組織IL-13水平差異有統(tǒng)計學意義，進一步進行兩兩比較，哮喘組IL-13水平(56.00±2.6ng/mgpro)較干預組(37.20±2.7ng/mgpro)及對照組(26.40±1.5ng/mgpro)增高，干預組較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義。 4各組小鼠肺組織內(nèi)STAT6及ORMDL3mRNA檢測結(jié)果 半定量測定結(jié)果顯示：STAT6mRNA及ORMDL3mRNA在三組中均有表達。二者均為哮喘組條帶亮度最強，干預組次之，對照組條帶亮度最弱。根據(jù)單因素方差分析結(jié)果：F=92.472，P0.05，三組間小鼠肺組織STAT6mRNA的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義，進一步進行兩兩比較，哮喘組STAT6mRNA的相對表達量(0.78±0.08)較干預組(0.52±0.05)及對照組(0.38±0.07)增高，干預組較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義。根據(jù)單因素方差分析結(jié)果：F=290.457，P0.05，三組間小鼠肺組織ORMDL3mRNA的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義，進一步進行兩兩比較，哮喘組ORMDL3mRNA的相對表達量(0.340±0.032)較干預組(0.194±0.026)及對照組(0.075±0.013)增高，干預組較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義。 5相關分析 Pearson相關分析示哮喘組STAT6mRNA及ORMDL3mRNA的表達水平呈正相關（r=0.676，P=0.032）；STAT6mRNA及ORMDL3mRNA的表達均與氣道壁厚度呈正相關，相關系數(shù)分別為（r=0.738，P=0.015r=0.668，P=0.035）。 結(jié)論 1. STAT6和ORMDL3可能參與了小鼠氣道重塑過程。 2.布地奈德可能通過下調(diào)STAT6mRNA及其蛋白和ORMDL3mRNA的表達，改善氣道炎癥及重塑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R725.6

【參考文獻】

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