本文關(guān)鍵詞： miR-455-5p 維A酸信號通路 STRA6 先天性膈疝肺發(fā)育不良　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:研究miR-455-5p調(diào)控維A酸信號通路膜受體STRA6在Nitrofen誘導(dǎo)的CDH發(fā)育不良的機(jī)制,闡明miR-455-5p～STRA6～CDH肺發(fā)育不良三者之間聯(lián)系,揭示CDH肺發(fā)育不良的發(fā)生機(jī)制,探討CDH病因,為預(yù)防CDH肺發(fā)育不良的發(fā)生及探索新的產(chǎn)前干預(yù)方法提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:1.利用生物信息學(xué)軟件對STRA6基因上游mircroRNAs進(jìn)行預(yù)測。2.應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證miR-455-5p調(diào)控STRA6基因。3.建立Nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝肺發(fā)育不良模型;QPCR檢測第15.5天miR-455-5p、STRA6mRNA在胎鼠肺中的表達(dá)變化;ELISA檢測胎鼠肺中維生素A的濃度變化。4.免疫組織化學(xué)及免疫熒光組織化學(xué)方法檢測胎鼠肺STRA6蛋白的表達(dá)。5.構(gòu)建miR-455-5p過表達(dá)腺病毒,轉(zhuǎn)染大鼠肺上皮細(xì)胞;Western Blotting檢測STRA6的蛋白表達(dá)水平變化;ELISA檢測細(xì)胞維生素A濃度的變化;CCK8檢測細(xì)胞增殖功能的變化。結(jié)果:1.利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測上游mircroRNAs的結(jié)果三個軟件共同預(yù)測表明STRA6基因上游的mircroRNA為miR-455-5p。2.雙熒光素酶報(bào)告基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析結(jié)果顯示:STRA6-WT+NC、STRA6-WT+miR-455-5p、STRA6-Mut+NC、STRA6-Mut+miR-455-5p 的平均相對熒光值分別為:1.000±0.023、0.521±0.025、1.000±0.014、0.768±0.008;miR-455-5p-5p mimic對STRA6野生型的報(bào)告熒光下調(diào)47.9%(30%),對其預(yù)測靶位點(diǎn)進(jìn)行突變后,突變型載體中的報(bào)告熒光有所恢復(fù),但仍下調(diào)23.2%;miR-455-5p可以調(diào)控STRA6基因的表達(dá)。3.動物模型的結(jié)果及QPCR檢測miR-455-5p、STRA6mRNA表達(dá)量,ELISA檢測胎鼠肺中維生素A的濃度變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Nitrofen誘導(dǎo)先天性膈疝肺發(fā)育不良大鼠模型的結(jié)果:6只對照組孕鼠于15.5天剖宮產(chǎn)得62只胎鼠肺樣本,6只Nitrofen誘導(dǎo)組孕鼠得到胎鼠45只,將各只孕鼠的胎鼠取出肺部,平均分配于各種實(shí)驗(yàn)方法;在第15.5天,Nitrofen誘導(dǎo)組和對照組miR-455-5p相對表達(dá)量分別為29.450±9.253、5.955±2.330,兩組相比,Nitrofen誘導(dǎo)組表達(dá)量明顯上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Nitrofen誘導(dǎo)組和對照組STRA6 mRNA相對表達(dá)量分別為:0.197±0.097、0.588±0.184,兩組相比,Nitrofen誘導(dǎo)組表達(dá)量明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Nitrofen組和對照組維生素A平均濃度(ug/ml)分別為:4.013±0.195、5.317±0.337,Nitrofen組維生素A濃度明顯下降,兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0000.05)。4.免疫組織化學(xué)及免疫熒光組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組織化學(xué):Nitrofen誘導(dǎo)組和對照組STRA6蛋白平均H-SCORE值分別為120.020±8.514、156.242±9.922,Nitrofen誘導(dǎo)組STRA6蛋白相對表達(dá)量明顯降低,兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光組織化學(xué):Nitrofen誘導(dǎo)組和對照組STRA6蛋白的平均IOD值分別為805.643±291.182、1616.391±572.308,兩組相比,Nitrofen誘導(dǎo)組相對表達(dá)量明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.miR-455-5p在大鼠肺上皮細(xì)胞過表達(dá)后對其靶基因STRA6、細(xì)胞維生素A濃度和細(xì)胞增殖功能影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果:miR-455-5p過表達(dá)組和N C組STRA6蛋白的相對表達(dá)量分別為:0.615±0.131、0.958±0.246,miR-455-5p過表達(dá)組的STRA6蛋白的相對表達(dá)量明顯下降,兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測細(xì)胞維生素A濃度結(jié)果:miR-455-5p過表達(dá)組和N C組細(xì)胞維生素 A平均濃度(ug/ml)分別為:2.985±0.061、3.949±0.118,miR-455-5p 過表達(dá)組的細(xì)胞維生素A濃度明顯下降,兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在24h、48h、72h、96h時,miR-455-5p過表達(dá)組和NC組平均光密度值分別為 0.280±0.184 和 1.354±0.169,0.881±0.016,和 1.992±0.050,2.937±0.079 和 2.105±0.148,4.955±0.021 和 3.315±0.043.在4個時間點(diǎn),miR-455-5p過表達(dá)組平均光密度值明顯減少,兩組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);兩組內(nèi)各個時間點(diǎn)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),兩組平均光密度值呈上升趨勢。結(jié)論:在Nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝肺發(fā)育不良模型中,miR-455-5p的表達(dá)異常升高,導(dǎo)致靶基因STRA6mRNA部分降解,STRA6蛋白表達(dá)下降,維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,引起肺組織維生素A濃度下降。在大鼠肺上皮細(xì)胞中,miR-455-5p過表達(dá)后,細(xì)胞中STRA6的蛋白表達(dá)量下降,維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,使細(xì)胞維生素A濃度下降,從而影響細(xì)胞增殖。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果:我們認(rèn)為miR-455-5p的異常升高是先天性膈疝肺發(fā)育不良的原因之一。
[Abstract]:Objective : To study the relationship between miR - 455 - 5p - 5p - 5p - 5p - 5p and miR - 455 - 5p in the lung of fetal mice . The average optical density of miR - 455 - 5p was 0.280 鹵 0.184 and 1.992 鹵 0.169 , 2.937 鹵 0.079 and 2.105 鹵 0.148 , 2.937 鹵 0.021 and 3.315 鹵 0.043 respectively .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R725.6

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本文編號：1486052