本文關(guān)鍵詞：EV71毒力表型差異與氨基酸突變關(guān)系的研究

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【摘要】：腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起兒童手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的重要病原。感染EV71后大多數(shù)患兒表現(xiàn)的癥狀較為輕微,如手足口部位的皰疹或皰疹性咽峽炎(Herpetic angina,HA);少數(shù)患兒能夠發(fā)生嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)炎癥等并發(fā)癥,如腦炎、腦膜炎、肺水腫甚至死亡。目前EV71感染致使CNS炎癥損傷機(jī)制并不完全明確。多數(shù)研究表明,由EV71感染引起臨床癥狀輕重的不同,一方面與被感染者身體免疫水平有關(guān),也與病毒本身毒力強(qiáng)弱有關(guān),即病毒基因組內(nèi)可能存在毒力相關(guān)位點(diǎn)。課題組前期在臨床分離得到6株不同毒力表型的EV71毒株,經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為強(qiáng)毒株組與弱毒株組,經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩組不同毒力的毒株基因組內(nèi)部發(fā)生了多處核苷酸的變異,并且引發(fā)了編碼區(qū)內(nèi)8處氨基酸發(fā)生了變化(結(jié)構(gòu)蛋白VP3-I537V,VP1-S639G;非結(jié)構(gòu)蛋白2A-P937 S/C/G,2B-V1014A,2B-I1062T,3C-V1597I,3C-N1617D和3D-V2146A)。為明確病毒毒力的差異是否是由于這些變異位點(diǎn)造成的,并且探明這些突變點(diǎn)與病毒毒力的關(guān)系,試驗(yàn)選取編碼區(qū)內(nèi)的8處變異位點(diǎn)作為研究對(duì)象,在EV71全長(zhǎng)cDNA感染性克隆(A12質(zhì)粒)基礎(chǔ)上逐一構(gòu)建了相應(yīng)的突變株病毒的感染性克隆并進(jìn)行了病毒拯救,并對(duì)拯救病毒突變前后在細(xì)胞上的復(fù)制能力作比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于3C蛋白酶上的nt5591(3C-N69D)位點(diǎn)突變后病毒復(fù)制能力明顯降低,甚至無法在RD細(xì)胞上進(jìn)行傳代。為進(jìn)一步明確nt5591位點(diǎn)變異致使病毒復(fù)制及感染能力降低的原因,我們對(duì)突變體3C蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)的模擬和分析,發(fā)現(xiàn)突變點(diǎn)臨近酶的活性中心,突變使活性中心的構(gòu)象發(fā)生變化,可能會(huì)對(duì)3C蛋白的功能造成影響。為驗(yàn)證猜想,我們將課題組前期在原核體系中克隆表達(dá)的對(duì)應(yīng)nt5591突變點(diǎn)的3C蛋白突變體(3C-N69D),在體外通過酶活實(shí)驗(yàn)與野生株3C蛋白進(jìn)行了酶活性的比較,結(jié)果顯示突變體蛋白3C-N69D與野生3C蛋白相比其活性顯著降低,切割不同底物多肽的能力分別下降了5-10倍。試驗(yàn)結(jié)果表明,nt5591位點(diǎn)的突變?cè)斐善渌诘?C蛋白酶活性下降,使其剪切病毒多聚蛋白的效率降低,從而抑制了病毒的復(fù)制,是造成兩組毒株毒力不同的根本原因。目的:運(yùn)用反向遺傳學(xué)的方法,構(gòu)建針對(duì)編碼區(qū)變異位點(diǎn)的8株EV71突變體感染性克隆并進(jìn)行病毒拯救,通過比較病毒突變前后復(fù)制能力的變化,找出對(duì)病毒性狀的改變產(chǎn)生作用的突變點(diǎn),進(jìn)而明確這兩組毒力不同的EV71毒株的編碼區(qū)內(nèi)8處氨基酸的變異是否與病毒復(fù)制或毒力有關(guān),并深入探尋變異位點(diǎn)影響病毒復(fù)制或毒力的機(jī)制。方法:1.在EV71全長(zhǎng)cDNA感染性克隆(A12質(zhì)粒)基礎(chǔ)上,利用Quikchange方法構(gòu)建針對(duì)編碼區(qū)的突變株cDNA感染性克隆,將其按照在編碼區(qū)的順序依次命名為M1-M8(由重株向輕株進(jìn)行突變),并進(jìn)行突變株病毒的拯救,將得到的拯救病毒M1-M8在核酸水平(RT-PCR)和蛋白水平(western blot、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn))進(jìn)行性質(zhì)檢測(cè),并在RD細(xì)胞進(jìn)行傳代驗(yàn)證;繪制拯救病毒的生長(zhǎng)曲線并分析突變點(diǎn)對(duì)病毒復(fù)制能力的影響,找出能影響病毒復(fù)制的關(guān)鍵位點(diǎn)。2.進(jìn)一步探尋致使M7株突變體病毒復(fù)制能力下降的原因。通過生物信息學(xué)手段分析突變位點(diǎn)對(duì)3C蛋白的影響,設(shè)計(jì)EV71-3C蛋白酶的多肽底物,通過酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突變體3C-N69D的活性變化情況,并結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡述突變與病毒毒力之間的關(guān)系。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了8株針對(duì)編碼區(qū)變異位點(diǎn)的突變體cDNA感染性克隆并在RD細(xì)胞上進(jìn)行拯救嘗試,除M7(突變點(diǎn)nt5591位于3C蛋白酶)和M8(突變點(diǎn)nt7179位于3D蛋白酶)外所有拯救病毒均能穩(wěn)定傳代,生長(zhǎng)曲線與未突變前相比無明顯改變;突變株M7和M8轉(zhuǎn)錄本RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后雖能表達(dá)病毒特異蛋白,但將轉(zhuǎn)染復(fù)合物繼續(xù)傳代后無法在細(xì)胞上產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)(Cytopathogenic effect,CPE),且不能在RD細(xì)胞上傳代;M7和M8回復(fù)突變驗(yàn)證結(jié)果顯示,M7經(jīng)回復(fù)突變后病毒恢復(fù)了野生株的生物學(xué)性狀,而M8的回復(fù)突變體病毒仍不能使細(xì)胞產(chǎn)生CPE現(xiàn)象也不能進(jìn)行傳代。2.通過結(jié)構(gòu)分析可知,突變點(diǎn)緊靠3C蛋白酶活性中心,N69D的突變?cè)斐闪舜呋?lián)體的構(gòu)象發(fā)生改變,可能影響酶的活性;酶活試驗(yàn)結(jié)果顯示,突變體蛋白3C-N69D與野生株3C蛋白相比切割底物的能力下降了5-10倍,酶活性顯著下降。分析得知N69D的突變極有可能是通過抑制3C蛋白酶的活性進(jìn)而阻礙病毒的復(fù)制功能。結(jié)論:位于編碼區(qū)3C蛋白的nt5591位點(diǎn)的變異是造成試驗(yàn)中兩組病毒株毒力不同的根本原因;變異位點(diǎn)引起3C蛋白酶活性中心構(gòu)像發(fā)生變化,使酶的活性顯著降低,切割底物效率下降,抑制了病毒的復(fù)制,可能是病毒的毒力相關(guān)位點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R725.1

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