本文關(guān)鍵詞：BMP對小鼠肝干細胞定向分化為肝實質(zhì)細胞的作用研究

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【摘要】：目的：以小鼠胚胎肝干細胞HP14.5為種子細胞，將已構(gòu)建的表達骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）2-15、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)和綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein,GFP)的重組腺病毒，分別感染小鼠胚胎肝干細胞HP14.5，誘導(dǎo)其分化，探討重組腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2-15（rAdBMP2-15）對誘導(dǎo)小鼠胚胎肝干細胞HP14.5向肝實質(zhì)細胞定向分化的作用，為肝干細胞移植在終末期肝病的臨床應(yīng)用打下理論和實驗基礎(chǔ)。 方法： 1.采用rAdBMP2-15、rAdHGF和rAdGFP分別感染小鼠胚胎肝干細胞HP14.5，誘導(dǎo)其分化，在病毒感染后的第1、4、7天采用熒光素酶報告基因檢測，從BMP家族成員中初步篩選出能有效誘導(dǎo)小鼠胚胎肝干細胞HP14.5向肝實質(zhì)細胞分化的BMP因子； 2.選擇誘導(dǎo)作用較強的BMP家族成員BMP9,分為BMP9組、HGF陽性對照組和GFP陰性對照組，，分別感染HP14.5細胞，在病毒感染后的第1、4、7和10天采用熒光素酶報告基因檢測Alb-Gluc活性；然后在第7天通過RT-PCR、Real-Time PCR和細胞免疫熒光等方法，檢測白蛋白(albumin，Alb)、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和細胞角蛋白18（cytokeratin18，CK18）等肝細胞相關(guān)標(biāo)志物的表達情況； 3.在第4、7、10天通過糖原合成染色(PAS)實驗、尿素氮合成功能檢測和吲哚菁綠(ICG)攝取功能試驗，探討B(tài)MP9誘導(dǎo)后HP14.5細胞的肝細胞功能狀況。 結(jié)果： 1.BMP2、BMP9和BMP10能有效誘導(dǎo)HP14.5細胞的Alb-Gluc活性增高，其中BMP9的作用最強。 2.熒光素酶報告基因Alb-Gluc表達活性檢測，誘導(dǎo)1、4、7和10天的BMP9組、HGF陽性對照組實驗細胞的Alb-Gluc表達活性隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸增加，在第7天達到峰值，到第10天Alb-Gluc表達趨于穩(wěn)定，較GFP陰性對照組明顯升高（P0.05）； 3.RT-PCR檢測，誘導(dǎo)7天后的BMP9組、HGF陽性對照組實驗細胞的Alb和CK18的mRNA表達明顯高于GFP陰性對照組，而AFP的mRNA表達較GFP陰性對照組顯著降低, Real-Time PCR進一步檢測，重復(fù)三次實驗結(jié)果與RT-PCR一致（P0.05）； 4.細胞免疫熒光染色，誘導(dǎo)7天后的實驗細胞胞漿內(nèi)表達肝細胞相關(guān)的Alb、CK18等蛋白，而GFP陰性對照組幾乎無表達； 5.PAS染色，BMP9組、HGF陽性對照組實驗細胞胞漿內(nèi)存在紫紅色顆粒，呈陽性反應(yīng)；且隨著時間的延長明顯加深，在第10天最明顯，而GFP陰性對照組呈弱陽性或陰性； 6.尿素合成功能檢測，BMP9組、HGF陽性對照組實驗細胞培養(yǎng)液中尿素氮讀數(shù)逐日上升，而對照組無明顯變化； 7.ICG攝取實驗，BMP9組、HGF陽性對照組實驗細胞的ICG攝取量隨著細胞誘導(dǎo)時間的延長而逐漸增加，在第10天細胞陽性率最高，其BMP9組和HGF陽性對照組的細胞陽性率分別為82%和80%左右，而GFP陰性對照組陽性率約為15%。 結(jié)論：從BMP家族成員2-15中篩選出具有誘導(dǎo)小鼠胚胎肝干細胞向肝實質(zhì)細胞方向分化的細胞因子BMP2、BMP9和BMP10；證實了BMP9具有一定的誘導(dǎo)HP14.5向成熟肝細胞樣細胞分化的作用，分化后的細胞具有成熟肝細胞的合成代謝功能。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R725.7

【參考文獻】

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本文編號：1248780