本文關(guān)鍵詞：BMP對(duì)小鼠肝干細(xì)胞定向分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的作用研究

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【摘要】：目的：以小鼠胚胎肝干細(xì)胞HP14.5為種子細(xì)胞，將已構(gòu)建的表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）2-15、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)和綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein,GFP)的重組腺病毒，分別感染小鼠胚胎肝干細(xì)胞HP14.5，誘導(dǎo)其分化，探討重組腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2-15（rAdBMP2-15）對(duì)誘導(dǎo)小鼠胚胎肝干細(xì)胞HP14.5向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞定向分化的作用，為肝干細(xì)胞移植在終末期肝病的臨床應(yīng)用打下理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.采用rAdBMP2-15、rAdHGF和rAdGFP分別感染小鼠胚胎肝干細(xì)胞HP14.5，誘導(dǎo)其分化，在病毒感染后的第1、4、7天采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，從BMP家族成員中初步篩選出能有效誘導(dǎo)小鼠胚胎肝干細(xì)胞HP14.5向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化的BMP因子； 2.選擇誘導(dǎo)作用較強(qiáng)的BMP家族成員BMP9,分為BMP9組、HGF陽(yáng)性對(duì)照組和GFP陰性對(duì)照組，，分別感染HP14.5細(xì)胞，在病毒感染后的第1、4、7和10天采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)Alb-Gluc活性；然后在第7天通過(guò)RT-PCR、Real-Time PCR和細(xì)胞免疫熒光等方法，檢測(cè)白蛋白(albumin，Alb)、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin18，CK18）等肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況； 3.在第4、7、10天通過(guò)糖原合成染色(PAS)實(shí)驗(yàn)、尿素氮合成功能檢測(cè)和吲哚菁綠(ICG)攝取功能試驗(yàn)，探討B(tài)MP9誘導(dǎo)后HP14.5細(xì)胞的肝細(xì)胞功能狀況。 結(jié)果： 1.BMP2、BMP9和BMP10能有效誘導(dǎo)HP14.5細(xì)胞的Alb-Gluc活性增高，其中BMP9的作用最強(qiáng)。 2.熒光素酶報(bào)告基因Alb-Gluc表達(dá)活性檢測(cè)，誘導(dǎo)1、4、7和10天的BMP9組、HGF陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的Alb-Gluc表達(dá)活性隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在第7天達(dá)到峰值，到第10天Alb-Gluc表達(dá)趨于穩(wěn)定，較GFP陰性對(duì)照組明顯升高（P0.05）； 3.RT-PCR檢測(cè)，誘導(dǎo)7天后的BMP9組、HGF陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的Alb和CK18的mRNA表達(dá)明顯高于GFP陰性對(duì)照組，而AFP的mRNA表達(dá)較GFP陰性對(duì)照組顯著降低, Real-Time PCR進(jìn)一步檢測(cè)，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR一致（P0.05）； 4.細(xì)胞免疫熒光染色，誘導(dǎo)7天后的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)肝細(xì)胞相關(guān)的Alb、CK18等蛋白，而GFP陰性對(duì)照組幾乎無(wú)表達(dá)； 5.PAS染色，BMP9組、HGF陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)存在紫紅色顆粒，呈陽(yáng)性反應(yīng)；且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)明顯加深，在第10天最明顯，而GFP陰性對(duì)照組呈弱陽(yáng)性或陰性； 6.尿素合成功能檢測(cè)，BMP9組、HGF陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)液中尿素氮讀數(shù)逐日上升，而對(duì)照組無(wú)明顯變化； 7.ICG攝取實(shí)驗(yàn)，BMP9組、HGF陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的ICG攝取量隨著細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在第10天細(xì)胞陽(yáng)性率最高，其BMP9組和HGF陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞陽(yáng)性率分別為82%和80%左右，而GFP陰性對(duì)照組陽(yáng)性率約為15%。 結(jié)論：從BMP家族成員2-15中篩選出具有誘導(dǎo)小鼠胚胎肝干細(xì)胞向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞方向分化的細(xì)胞因子BMP2、BMP9和BMP10；證實(shí)了BMP9具有一定的誘導(dǎo)HP14.5向成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的作用，分化后的細(xì)胞具有成熟肝細(xì)胞的合成代謝功能。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R725.7

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：1248780