本文關(guān)鍵詞：一氧化碳對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的新生鼠急性肺損傷的抑制作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 一氧化碳釋放分子3 脂多糖 肺損傷 凋亡 肺泡二型上皮細(xì)胞

【摘要】：背景急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是由于各種直接或間接的致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,表現(xiàn)為肺的順應(yīng)性下降、頑固性的低氧血癥、高碳酸血癥、呼吸窘迫,最終發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ALI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,目前還沒(méi)有完全闡述清楚。以往研究認(rèn)為,炎癥反應(yīng)是誘發(fā)和加重ALI的決定性因素。當(dāng)機(jī)體受到外源性刺激或者自身生理機(jī)能紊亂時(shí),免疫系統(tǒng)被激活,引起相關(guān)趨化因子和炎性因子的釋放以及中性粒細(xì)胞的大量聚集,以抵抗和清除對(duì)機(jī)體有害的各種因素。而炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體自身也存在傷害作用,過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)加重生理機(jī)能受損,在肺組織中主要表現(xiàn)為肺的血?dú)饨粨Q屏障受損。與成年人相比,新生兒的肺泡發(fā)育還不夠完善,自身調(diào)節(jié)能力有限,很容易受到各種外來(lái)刺激的影響而發(fā)生功能障礙。1989年,Faix等率先報(bào)道了11例足月新生兒ALI/ARDS,之后相繼有足月新生兒、早產(chǎn)兒、低體重兒等多種類型ALI/ARDS的病例報(bào)道。近年來(lái),有關(guān)新生兒ALI/ARDS的報(bào)道越來(lái)越多,研究中發(fā)現(xiàn),新生兒ALI與成人和兒童均有所不同,其起病更快,病程進(jìn)展更迅速,低氧血癥更為嚴(yán)重。在新生兒ALI的誘發(fā)因素中,胎糞吸入和感染是最常見(jiàn)的兩個(gè)發(fā)病原因。一氧化碳(Carbon monoxide,CO)在體內(nèi)微量存在,主要由血紅素加氧酶(Heme oxygenase,HO)分解血紅素生成。目前的研究表明,CO在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理調(diào)節(jié)作用,包括擴(kuò)張血管、抗炎癥、抗凋亡、抗細(xì)胞增殖等作用。在各種ALI的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn),低劑量的CO具有明顯減輕ALI的作用,其機(jī)制研究主要集中在CO的抗炎癥作用方面。而對(duì)于CO的抗凋亡作用,尤其是對(duì)肺泡二型上皮細(xì)胞(Alveolar typeⅡepithelial cells,AEC-Ⅱ)的凋亡影響迄今還未見(jiàn)報(bào)道。目的探討CO對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的新生鼠ALI時(shí)AEC-Ⅱ凋亡的影響及其分子機(jī)制。方法一、CO對(duì)LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI的影響1.創(chuàng)建LPS誘導(dǎo)新生鼠ALI模型,通過(guò)觀察肺組織病理變化,濕干比(Wet-to-dry ratio,W/D),肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白細(xì)胞數(shù)量和蛋白含量變化確定模型建立是否成功;2.制備失活性一氧化碳釋放分子3(Inactive carbon monoxide releasing molecule3,i CORM3):將制備好的一氧化碳釋放分子3(Carbon monoxide releasing molecule3,CORM3)于室溫下放置18h,使CORM3充分分解釋放出CO氣體,剩下的部分即為羰基骨架結(jié)構(gòu)i CORM3;3.觀察CORM3對(duì)LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI的保護(hù)作用,觀察指標(biāo):H-E染色,W/D比值、BALF中白細(xì)胞數(shù)量及蛋白含量變化;4.觀察CORM3對(duì)LPS誘導(dǎo)的新生鼠AEC-Ⅱ凋亡的影響,末端標(biāo)記法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL)染色觀察肺泡細(xì)胞凋亡情況,TUNEL+肺表面活性物質(zhì)C(Surfactant protein C,SP-C)免疫熒光觀察AEC-Ⅱ凋亡變化。二、CO對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡影響1.MTT法觀察不同濃度LPS對(duì)A549細(xì)胞活力的影響;2.MTT法觀察不同濃度CORM3對(duì)LPS刺激的A549細(xì)胞活力的影響;3.TUNEL法觀察CORM3對(duì)LPS刺激的A549細(xì)胞凋亡的影響;4.JC-10染色觀察線粒體膜電位變化;5.蛋白免疫印跡法(Western-Blot,WB)檢測(cè)線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C(Cytochrome C)含量變化;6.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa)檢測(cè)活化的Caspase 3變化。結(jié)果一、CO對(duì)LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI的影響1.與control組相比,LPS組肺組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂,肺間隔明顯增寬,肺泡及其間質(zhì)內(nèi)大量中性粒細(xì)胞堆積;W/D比值、BALF細(xì)胞數(shù)量及蛋白含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CORM3組與LPS相比,肺組織病理變化明顯改善,肺泡及間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少;W/D比值、BALF中白細(xì)胞數(shù)目及蛋白含量升高趨勢(shì)明顯回落,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。i CORM3組與LPS組相比,上述觀察與檢測(cè)指標(biāo)無(wú)明顯變化(P0.05)。說(shuō)明在LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI中,CORM3能起到明顯的抑制作用。2.與control組相比,LPS組肺組織AEC-Ⅱ凋亡明顯增加,二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);CORM3組與LPS相比,肺組織AEC-Ⅱ凋亡數(shù)目明顯減少,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);i CORM3組與LPS組相比,上述指標(biāo)無(wú)明顯變化(P0.05)。說(shuō)明在LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI中存在AEC-Ⅱ凋亡,CORM3干預(yù)能抑制新生鼠ALI中的AEC-Ⅱ凋亡。二、CO對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡影響1.隨著LPS作用濃度的增加,A549細(xì)胞活力明顯下降,其趨勢(shì)變化在100-400ug/ml濃度之間最為顯著(P0.05)。2.與LPS組相比,給予CORM3干預(yù)后,A549細(xì)胞活力明顯增強(qiáng),且增強(qiáng)趨勢(shì)與CORM3濃度呈正相關(guān);i CORM3組與LPS組相比無(wú)明顯變化(P0.05)。3.與control組相比,LPS組TUNEL熒光信號(hào)明顯增強(qiáng),提示A549細(xì)胞凋亡增多,二者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);CORM3組與LPS相比,A549細(xì)胞凋亡數(shù)目有所減少,二者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);而i CORM3組無(wú)明顯變化(P0.05)。4.在control組中,JC-10以聚合體形式存在于線粒體內(nèi)膜中,顯微鏡下顯示紅色熒光信號(hào),線粒體膜電位水平較高;LPS組JC-10主要以單體形式存在,顯微鏡下以綠色熒光為主,說(shuō)明線粒體膜電位下降明顯;給予CORM3干預(yù)后,細(xì)胞線粒體膜電位有所回升,而i CORM3組無(wú)明顯變化。5.在control組中,Cytochrome C主要存在于線粒體中,胞漿含量較少;經(jīng)LPS刺激后,線粒體內(nèi)Cytochrome C有所減少,胞漿內(nèi)Cytochrome C含量增多;給予CORM3干預(yù)后,線粒體內(nèi)Cytochrome C逐漸增多;在i CORM3組中,線粒體內(nèi)Cytochrome C含量與LPS組相比無(wú)明顯變化。這些結(jié)果表明:LPS刺激后,線粒體膜電位降低,通透性增強(qiáng),線粒體內(nèi)Cytochrome C轉(zhuǎn)移進(jìn)入胞漿中,給予CORM3干預(yù)后,抑制了線粒體內(nèi)Cytochrome C進(jìn)入胞漿的趨勢(shì)。6.與control組相比,給予LPS刺激以及CORM3治療,Caspase 3活性均無(wú)明顯變化(P0.05)。結(jié)論1.CO能減輕LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI;2.CO能抑制LPS引起的ALI時(shí)AEC-Ⅱ凋亡;3.CO能降低LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡,且作用機(jī)制可能并不依耐于Caspase途徑。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R722.1

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本文編號(hào)：1230024