本文關(guān)鍵詞：小兒腎母細胞瘤血清創(chuàng)傷應激相關(guān)因子的篩選與鑒定

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【摘要】：研究背景 腎母細胞瘤(Wilms tumor)又稱腎胚胎瘤(embryonic tumor of kidney),又稱Wilms瘤(WT),是小兒中最常見的腹膜后的惡性實質(zhì)性腫瘤之一,其發(fā)病率于小兒腹部實體腫瘤中占第一位,特別是在15歲以下的小兒泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中占有很大比例,占80%以上,主要發(fā)生在生后前5年內(nèi),2-4歲多見。左右兩側(cè)發(fā)病率幾乎相同,但是雙側(cè)腫瘤同時發(fā)病比較少,其約占腎母細胞瘤總發(fā)病率的3-10%,相繼或同時發(fā)生。男女性患兒的發(fā)病率幾乎無差別,但是有很多研究表明男性患兒發(fā)病率略高于女性患兒。目前為止大家認為分型及分期是影響患兒預后的主要因素,與腫瘤具體大小無明顯關(guān)系。早期的診斷對于腎母細胞瘤的治療方式以及患兒治療后的效果具有重要意義。腎母細胞瘤患兒的早期臨床表現(xiàn)不明顯,而且因為其發(fā)病年齡較低,患者多數(shù)為小兒或嬰兒,容易受家長或醫(yī)生的忽視而導致其就醫(yī)時間延遲,診斷明確延遲。目前的檢查方法主要是：超聲檢查、CT及磁共振及排泄性尿路造影(IVU)等,并結(jié)合臨床診斷,才能基本確定腎母細胞瘤,而明確診斷要靠病理診斷,病理診斷是檢查的金標準,理想的早期診斷手段正在探索中。目前運用于腎母細胞瘤血液檢查初步診斷的相關(guān)性標記物的敏感性和特異性都比較差,診斷價值有限。上述各種相關(guān)情況決定了現(xiàn)無論在手術(shù)還是化療、放射治療抑或生物治療上,對中晚期的。腎母細胞瘤患兒的治療是臨床上的重點,如此也必然會直接影響到治療后的效果。據(jù)了解美國國家腎母細胞瘤研究協(xié)作組研究表明,與治療方法無關(guān),腎母細胞瘤患兒的生存率是隨著腫瘤分期的升高而下降,故中晚期患兒面臨巨大的死亡風險。由此我們可以看出,依靠現(xiàn)有的實驗技術(shù)找尋一種簡便、易行、準確的早期檢測方法檢測小兒腫瘤以使腎母細胞瘤患兒能夠得到早期診斷而更早的治療并獲得長期生存率是現(xiàn)在小兒外科醫(yī)學迫切要求的。 最早于1994年蛋白質(zhì)組學這一概念被提出后就獲得了大量的認可和研究。本質(zhì)上是指在大規(guī)模的水平上通過特殊方法研究蛋白質(zhì)的特征。無論是量還是質(zhì)的變化,任何的疾病、任何機體活動在蛋白質(zhì)水平上都會發(fā)生改變。因此我們可以根據(jù)蛋白質(zhì)水平變化建種以監(jiān)測某種疾病的特異性蛋白質(zhì)水平量或質(zhì)的變化以達到對該種疾病早期診斷的目的的診斷系統(tǒng),這也是現(xiàn)在臨床醫(yī)生和科研工作者對于疾病,特別是腫瘤的早期診斷的一個特殊的重要的研究方向。而找尋對應某種疾病發(fā)生發(fā)展的特異性蛋白質(zhì)則成了研究的核心問題。隨著蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)的更新發(fā)展,許多疾病蛋白質(zhì)標記物被檢測出并鑒定。在藥物目標靶點和疾病特異蛋白質(zhì)標記物篩選中應用蛋白組學的研究方法被人們認為是最有效果和便捷的方法之一,由此我們可以看出,該相關(guān)技術(shù)為尋找準確簡便可行的腎母細胞瘤篩查和早期檢測手段提供了一種可能。蛋白質(zhì)組學技術(shù)可快速高通量的篩查檢測疾病發(fā)生的不同階段基因表達的蛋白質(zhì)表達情況,從而檢測到有診斷意義的特異蛋白質(zhì)標記分子,而這些高表達的特異蛋白能為早期診斷提供依據(jù),也可能為疾病的治療提供靶點,將有望更好地服務于臨床。2002年科研工作者發(fā)明了表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀器(SELDI-TOF-MS),蛋白質(zhì)芯片技術(shù)由此已廣泛用于各類疾病特異性蛋白標志物的篩選及檢測,在不斷發(fā)展中取得了一系列突破性研究進展。該研究方法有許多優(yōu)點,其靈敏度高、操作簡便、快速高通量、樣品用量小,通過結(jié)合LC-MS/MS、 MALDI-TOF-MS等新技術(shù)已經(jīng)鑒定出了諸多腫瘤如乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤血清中的特異性蛋白質(zhì)。 本研究是應用SELDI技術(shù)檢測腎母細胞瘤患兒病例血清、創(chuàng)傷應激患兒血清及正常小兒血清中的蛋白,篩選出特異性高表達的蛋白質(zhì),并應用質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)對篩選出的特異性蛋白質(zhì)進行鑒定,找出創(chuàng)傷應激相關(guān)因子,從而兩者共同構(gòu)成腎母細胞瘤創(chuàng)傷和非創(chuàng)傷性的蛋白標記物。在應用蛋白質(zhì)組學幾項重要技術(shù)基礎(chǔ)上,包括SELDI MALDI SPE、HPLC與LC-MS的串聯(lián)使用,通過對腎母細胞瘤患兒的病例血清、創(chuàng)傷應激患兒血清及正常小兒血清中對蛋白質(zhì)定性定量比較分析,篩選并鑒定腎母細胞瘤患兒和創(chuàng)傷應激患兒血清中特異性高表達的蛋白質(zhì),此特異性蛋白質(zhì)標記物為對前期篩選的腎母細胞瘤特異標志物的其他蛋白區(qū)分干擾及進一步驗證提供了參考和意見。在前期工作中,我們付出了很大努力找出了許多相關(guān)特異性標記物,得到前期成果m／z為6438的特異性標記物,鑒定為載脂蛋白C-I,但是,由于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的壓迫周圍組織或出血等創(chuàng)傷作用可產(chǎn)生一定的相關(guān)因子,同時患兒本身其他疾病及癌組織或癌旁組織能產(chǎn)生某些非特異或含量較少的蛋白或物質(zhì),使腫瘤患者血清中的篩查出的特異蛋白質(zhì)在質(zhì)和量上無法區(qū)分于某些創(chuàng)傷應激性患兒或良性疾病患兒。創(chuàng)傷應激性疾病與腎母細胞瘤病例表達的蛋白質(zhì)可能存在著一定的相關(guān)性。由于炎癥及創(chuàng)傷氧化應激對腫瘤患者血清蛋白質(zhì)的質(zhì)和量上的干擾,產(chǎn)生許許多多種類的相關(guān)蛋白質(zhì),則會使前期成果原已被鑒定為特異性蛋白標志物的可信度和應用性大大降低,因為免疫系統(tǒng)和體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用導致了有某些混雜入腎母細胞瘤血液的蛋白質(zhì)同樣被檢測。所以本次篩選腎母細胞瘤特異性蛋白質(zhì)標記物的工作中,我們將在腫瘤血清中找尋創(chuàng)傷應激相關(guān)的特殊蛋白或物質(zhì),與非創(chuàng)傷性特異標記物相鑒別并共同構(gòu)建完善的指紋圖譜模型。 研究目的 篩選并鑒定小兒腎母細胞瘤血清創(chuàng)傷應激相關(guān)因子,與非創(chuàng)傷應激性蛋白標記物相鑒別,為研究腎母細胞瘤血清早期診斷和預后監(jiān)測的特異蛋白標志物的價值和前景打下基礎(chǔ)。 材料與方法 1.1血清樣本收集和處理 本課題所選取的血清樣本均來源于鄭州大學第一附屬醫(yī)院小兒外科,包括61例腎母細胞瘤患兒(預后良好型)術(shù)前血清樣本(Ⅰ stage28, Ⅱ stage18, Ⅲ stage12and IV stage3(分期依據(jù)NWTS-5標準)；34例創(chuàng)傷應激患兒血清樣本,血清收集時間為患兒受車禍等事故創(chuàng)傷1-3天內(nèi)；60例正常對照小兒血清來源于體檢小兒。腎母細胞瘤患兒術(shù)前血清組、正�；純貉褰M及創(chuàng)傷患兒血清組均于外周靜脈全血標本清晨空腹時抽取,在4℃下靜置1-2h后,3000r／min離心15min,取血清,分別編號分管分開-80。C冰箱中保存。 1.2血清差異蛋白篩選 SELDI-TOF：腎母細胞瘤患兒血清組和對照組血清在冰浴上緩慢融解(30-60分鐘),融解后4。C離心10000rpmx5min,取5μL血清,加入10μlU9血清處理液中,4。C的條件下?lián)u床上振蕩使其充分混合(600rpmx30min):用Binding Buffer將U9處理后的血清稀釋至200μl,4℃搖床上振蕩使充分混合(600rpmx2min)后用于WCX2蛋白芯片上樣。首先應用已知分子量的標準蛋白芯片All-in-One將SELDI質(zhì)譜系統(tǒng)的分子量誤差校正至0.1%,再將結(jié)合好蛋白質(zhì)的芯片放入質(zhì)譜儀中檢測。原始數(shù)據(jù)由工具Proteinchip Software3.2軟件采集,激光強度設置為185,檢測靈敏度設置為7,檢測上限100,000M／z,優(yōu)化收集數(shù)據(jù)范圍2000-20000M／z。查閱文獻得到的待排除因子在每組篩選差異性峰時都分別加樣(加入的樣品為重組的以上蛋白質(zhì)),參加對比,如果差異性峰與某中帶排除因子的峰值相對應,說明質(zhì)荷比相同,也就說明此種差異性蛋白即為無關(guān)因子,不需要再對其進一步純化和鑒定,將對比產(chǎn)生的創(chuàng)傷性特殊因子的有意義峰或差異峰進行鑒定。 1.3數(shù)據(jù)處理 1)應用工具Ciphergen Biosystems軟件3.1版本對原始數(shù)據(jù)進行校正,使得總離子強度與分子量的均一化。 2) Biomarker Wizard和ZUCI蛋白質(zhì)芯片數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)通過離散小波以去除噪音,并且減掉基線。應用局部極值的方法找尋出樣本各自的峰,并且過濾出信噪比(S／N)大于2之峰。聚類分析的最小閾值設置為10%,歸類樣本中質(zhì)荷比(M／z)差異小于0.3%之峰。 3)每個M／z峰對樣本區(qū)分的差異顯著性有所不同。初步篩選出的M／z峰做Wilcoxon秩和檢驗,得出P值來衡量每峰區(qū)分各個組別的能力。 4)非線性支持向量機(SVM)分類器對各個樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)進一步分析,篩選出蛋白質(zhì),找尋差異性蛋白質(zhì)。所選用的SVM分類器應用徑向基核函數(shù),設置γ參數(shù)為0.6,設置罰分函數(shù)為19。 1.4統(tǒng)計學方法 將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾噪音,經(jīng)過聚類分析處理,對各個組別質(zhì)譜數(shù)據(jù)芒檢驗。檢驗標選α=0.01。確定組間差異蛋白。 1.5血清蛋白質(zhì)分離 通過固相萃取技術(shù)(SPE)按30%,50%,70%,100%有機相濃度分裝,做好記錄,根據(jù)親疏水性把蛋白類別分開,后放入真空干燥儀中干燥至10ul,加入Sample Buffer5ul,煮沸15min,離心5000r/min,收集上清液。處理后的樣本經(jīng)過凝膠電泳分離,根據(jù)距離把分子量不同的蛋白分開,對應的分子量軸上切膠,分裝至不同EP管中,經(jīng)過洗滌、脫色、干燥,最后加入胰蛋白酶,酶解出目標蛋白。 1.6MALDI-TOF-MS確定差異性蛋白 經(jīng)SPE及電泳分離的各種蛋白質(zhì)與a-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid (CHCA)各取1.5ul,兩者混合,置入靶板上,待干。用Cytochrome C(分子量12361.96)+CHCA和Insulin(分子量5734.51)+CHCA校樣。靶板置入MALDI-TOF-MS儀器內(nèi)進行檢測。跟蹤目標蛋白峰,確定質(zhì)荷比為5816的蛋白質(zhì)峰的血清樣品。 1.7特異蛋白質(zhì)的鑒定 取經(jīng)酶解后的血清蛋白質(zhì)液填柱上樣；經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜掃描后得到得肽質(zhì)量指紋圖譜,再經(jīng)過Mascot檢索軟件在Swissprot數(shù)據(jù)庫中查詢比對。 1.8MALDI-TOF-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理及數(shù)據(jù)庫檢索 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理工具軟件為日本島津公司的Launchpad2.4, PMF圖譜檢索采用在線的Mascot檢索工具得以完成。其采用小鼠源以及人源蛋白質(zhì)序列作為數(shù)據(jù)庫,以trypsin酶解,允許的最大漏切位點數(shù)設置為1；固定修飾是半胱氨酸碘代乙酰化；可變修飾是甲硫氨酸氧化；肽段的質(zhì)量容忍度設置為±0.3Da(Monoisotopic peak)。 結(jié)果 l.SELDI-TOF-MS檢測：腎母細胞瘤血清組和正常小兒組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過初步過濾篩選和統(tǒng)計分析后得出P值小于0.01的m／z峰15個,從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預測值的youden指數(shù)(陽性率與陰性率之差)最高的組合模型,篩出m／z位于5816的蛋白質(zhì)峰標志物,在腎母細胞瘤組高表達(強度為2128.3±137.2),正常小兒組明顯低表達(強度為30.4±7.8),差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),經(jīng)交叉檢測,在測試集上判別該標志物組合模型的特異性為100%,敏感度為100%。正常血清組和創(chuàng)傷應激血清組比較篩選到差異最顯著的m／z位于5816的蛋白質(zhì)標志物,.在創(chuàng)傷組血清中高表達(強度為3674.6±255.7),正常組中呈明顯低表達(強度為30.4±7.8),差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)；腎母細胞瘤血清組和創(chuàng)傷應激組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 2.質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索：酶解蛋白質(zhì)樣品后,采用LC-MS/MS測定該蛋白質(zhì)的酶解肽段,將檢測得到的PMF經(jīng)過Mascot檢索程序查詢蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫,查得對應可能的蛋白質(zhì)為：m／z5816Da,鑒定為硫氧還蛋白(thioredoxin),所檢測到的肽段氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中的序列匹配率為20.00%。 結(jié)論 1、小兒腎母細胞瘤血清創(chuàng)傷應激相關(guān)炎癥因子為硫氧還原蛋白。 2、結(jié)合前期成果,與非創(chuàng)傷性標記物載脂蛋白C-I相鑒別,腎母細胞瘤血清中存在創(chuàng)傷應激相關(guān)因子,在一定程度上促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R737.11

【參考文獻】

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1 田美娟;李雨遙;羅長琴;呂美玲;楊謹;;腎透明細胞癌中氧化應激蛋白的表達[J];細胞與分子免疫學雜志;2012年08期

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本文編號：1183061