本文關(guān)鍵詞：醫(yī)用臭氧對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)缺氧腦損傷的影響

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【摘要】：[研究背景]新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指圍生期各種因素,主要是指窒息,引起的新生兒腦能量代謝及功能障礙,重者出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀,如抽搐、昏迷等,甚至在嬰兒期死亡,幸存者可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,HIE是兒童致殘的重要原因。盡管目前圍生醫(yī)學(xué)在不斷的進(jìn)步,圍產(chǎn)期窒息患兒發(fā)生率在逐漸減少,但HIE仍是一種威脅嬰幼兒健康的嚴(yán)重疾病,目前尚無(wú)特效治療。在國(guó)外亞低溫治療已經(jīng)成為新生兒腦損傷的常規(guī)治療,方法有選擇性頭部降溫或全身降溫。但TaginMA等進(jìn)行Meta分析時(shí),總結(jié)多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明亞低溫治療對(duì)新生兒中度腦病作用顯著,對(duì)新生兒重度腦病作用不明顯。亞低溫雖然在國(guó)外廣泛用于臨床,但在國(guó)內(nèi)還未全面推廣,作為臨床醫(yī)師要認(rèn)清其禁忌癥及并發(fā)癥,選擇亞低溫治療時(shí)要確保再灌注損傷階段的各種生理病理反應(yīng)已減輕。當(dāng)患兒存在嚴(yán)重感染,凝血功能障礙或多器官功能衰竭時(shí)要慎重選擇該治療方案。同時(shí)要注意治療時(shí)間窗的選擇,一般在出生后6小時(shí)內(nèi),如果延遲至發(fā)病后8.5小時(shí),亞低溫治療則沒(méi)有神經(jīng)保護(hù)作用。在國(guó)內(nèi)被認(rèn)為能夠有效改善HIE患兒預(yù)后的治療方法是高壓氧(HBO)治療,它能改善患兒的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,降低病死率和幸存患兒后遺癥發(fā)生率。國(guó)內(nèi)大量的臨床研究肯定了HBO對(duì)新生兒HIE的近期療效較好,但缺乏多中心隨機(jī)研究,關(guān)于HBO的遠(yuǎn)期療效報(bào)道少。然而,國(guó)外醫(yī)學(xué)并不十分支持HBO在臨床的應(yīng)用,他們認(rèn)為HBO在治療局部缺血性腦卒中時(shí)能改善神經(jīng)行為和梗死面積,但應(yīng)用到臨床上尚需要更多的臨床前研究證明HBO的有效性及作用機(jī)制。其它治療方法如氧自由基抑制劑和清除劑,興奮性氨基酸拮抗劑、神經(jīng)保護(hù)劑、干細(xì)胞移植、基因治療等尚需更多的動(dòng)物研究和臨床驗(yàn)證。臭氧用于消毒和治療疾病有150年的歷史了。1840年德國(guó)化學(xué)家C.F.Schonbein電解水的時(shí)候發(fā)現(xiàn)一種特殊臭味的氣體,將它命名為臭氧。在一戰(zhàn)期間,德國(guó)士兵將臭氧用于治療厭氧菌感染所致的氣性壞疽,發(fā)現(xiàn)臭氧能控制感染,有抗炎的特性。1857年,兩位德國(guó)物理學(xué)家發(fā)明第一臺(tái)醫(yī)用臭氧發(fā)生機(jī),臭氧治療開(kāi)始用于臨床。1929年美國(guó)出版了一本名為《臭氧及其醫(yī)療作用》的書(shū),書(shū)中描述了臭氧能治療114種疾病。上個(gè)世紀(jì)50年代,由于缺乏基礎(chǔ)和臨床研究及臭氧本身存在的危害,臭氧的治療效果受到各界的質(zhì)疑。后來(lái)隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷進(jìn)展,積累了大量研究結(jié)果,其作用機(jī)制及效果逐漸被闡明,醫(yī)用臭氧逐漸被醫(yī)學(xué)工作者認(rèn)可。1999年,意大利發(fā)起并建立了國(guó)際臭氧醫(yī)療協(xié)會(huì)(IMOS),旨在促進(jìn)醫(yī)用臭氧在臨床的研究與應(yīng)用,制定臭氧治療規(guī)范。目前臭氧主要用于治療腰椎間盤(pán)突出、關(guān)節(jié)痛、肩周炎、糖尿病潰瘍等疾病。臭氧在細(xì)胞有氧代謝及抗氧化防御系統(tǒng)方面起積極的作用,是治療能量衰竭有關(guān)疾病的基礎(chǔ)。臭氧能減少血膽固醇,刺激抗氧化應(yīng)答,在靜止肌修飾氧合作用,改善神經(jīng)功能,是缺氧和缺血綜合征的補(bǔ)充治療。動(dòng)物,如大鼠、小鼠、兔、猴,對(duì)人類(lèi)生物的研究有巨大的貢獻(xiàn)。除了人們熟悉的鼠、兔等動(dòng)物外,斑馬魚(yú)作為一種逐漸興起的脊椎模式動(dòng)物,憑借其節(jié)約成本、繁殖能力強(qiáng)、體積小、發(fā)育迅速、胚胎透明能夠輕易連續(xù)觀(guān)察發(fā)育階段以及其基因與人類(lèi)基因高度相似等特點(diǎn)已成為生物學(xué)家的新選擇。斑馬魚(yú)基因表達(dá)是保守的,與人類(lèi)有69%的同源性,47%的人類(lèi)基因與斑馬魚(yú)同源基因一一對(duì)應(yīng)。通過(guò)檢測(cè)3176個(gè)人類(lèi)致病基因,發(fā)現(xiàn)其中有82%在斑馬魚(yú)至少有一個(gè)同源基因。這也就意味著在斑馬魚(yú)身上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適于人體,所以斑馬魚(yú)模型可以用于人類(lèi)疾病的研究。斑馬魚(yú)可以模擬多種人類(lèi)疾病,已有研究者利用斑馬魚(yú)胚胎和成魚(yú)制作缺氧缺血性腦損傷模型,研究其發(fā)病機(jī)制及治療方法。[研究目的和意義]基于以上的研究背景,本實(shí)驗(yàn)旨在利用便捷、高效的斑馬魚(yú)模型構(gòu)建斑馬魚(yú)幼魚(yú)缺氧再灌注損傷模型,模擬新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD),探討應(yīng)用醫(yī)用臭氧對(duì)新生兒腦損傷的作用機(jī)制及影響。本研究通過(guò)觀(guān)察對(duì)腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)(超氧化物歧化酶(SOD)活性、(丙二醛)MDA、總抗氧化水平)及SODmRNA表達(dá)水平的影響,結(jié)合斑馬魚(yú)幼魚(yú)行為及病理學(xué)改變,探討醫(yī)用臭氧對(duì)缺氧性腦損傷的斑馬魚(yú)幼魚(yú)是否具有保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制,為新生兒缺氧缺血性腦損傷開(kāi)拓治療思路,并探索不同濃度對(duì)干預(yù)效果的影響,為進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平的研究資料,以期為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。[研究方法]1.動(dòng)物模型的分組與建立同一批次野生型斑馬魚(yú)卵受精后5天(dpf),缺氧實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分為正常對(duì)照組、H/R組(hypoxia/reoxygen,系統(tǒng)水復(fù)氧)、處理組(缺氧-醫(yī)用臭氧復(fù)氧組),其中處理組根據(jù)臭氧濃度不同分為：0.05ppm、0.1ppm、0.2ppm三個(gè)亞組。均勻向密閉水箱中充入高純氮?dú)?溶氧儀監(jiān)測(cè)氧濃度,當(dāng)水中溶解氧低于0.5mg/L時(shí),將H/R組和各處理組幼魚(yú)放入缺氧裝置中,建立斑馬魚(yú)幼魚(yú)缺氧腦損傷模型。到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),即幼魚(yú)沉底靜止不動(dòng)達(dá)1min,身體彎曲或抽搐,將幼魚(yú)撈出,分別放入系統(tǒng)水和醫(yī)用臭氧中進(jìn)行復(fù)蘇,以缺氧/復(fù)氧后3h為觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)。正常對(duì)照組水中溶解氧濃度在7.5mg/L左右。2.各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)方法2.1 幼魚(yú)的一般狀況復(fù)蘇期間計(jì)時(shí)各組幼魚(yú)蘇醒時(shí)間,顯微鏡下觀(guān)察缺氧/復(fù)氧后3h幼魚(yú)心率變化、運(yùn)動(dòng)能力、生存分析等指標(biāo)，初步評(píng)估缺氧/復(fù)氧對(duì)幼魚(yú)生存狀態(tài)的影響及醫(yī)用臭氧對(duì)幼魚(yú)的影響。2.2腦組織病理變化顯微鏡下觀(guān)察TUNEL染色腦組織細(xì)胞凋亡變化。2.3腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)測(cè)定各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)缺氧/復(fù)氧后3h腦組織SOD、MDA、總抗氧化水平氧化應(yīng)激指標(biāo)。2.4腦組織SODmRNA表達(dá)水平利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析幼魚(yú)缺氧/復(fù)氧后3h腦組織SODmRNA表達(dá)水平。3.統(tǒng)計(jì)方法對(duì)檢測(cè)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述,正態(tài)分布計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,結(jié)果用spss20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析；兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,其中方差齊者用LSD法,方差不齊者用Dunnett's法進(jìn)行分析。Kaplan-Meier法用于估計(jì)生存函數(shù)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Graphpad Prism 5.0作圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的圖片處理。[結(jié)果]1.動(dòng)物一般狀況正常組斑馬魚(yú)幼魚(yú)一般狀況良好,心率平穩(wěn),運(yùn)動(dòng)能力正常。缺氧/復(fù)氧后3hH/R組幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)能力減弱,游程縮短,出現(xiàn)抽搐、靜止不動(dòng)等表現(xiàn)。缺氧/復(fù)氧后3h內(nèi)各組幼魚(yú)(H/R組、0.05ppm-臭氧組、0.1ppm臭氧組、0.2-ppm臭氧組)平均蘇醒時(shí)間分別為：37.5±6.1 min、 33.0±3.8mm、32.5±5.0min、32.6±5.6min,其中H/R組幼魚(yú)平均蘇醒時(shí)間最長(zhǎng),差異有顯著性。與正常對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)相比,0.1ppm復(fù)氧組幼魚(yú)心率和H/R幼魚(yú)平均心率稍慢,但差異無(wú)明顯差異,0.05ppm復(fù)氧組和0.2ppm復(fù)氧組幼魚(yú)心率加快,但差異無(wú)顯著性。缺氧后14天內(nèi),正常對(duì)照組、H/R及各處理組(0.05ppm、0.1ppm、0.2ppm)幼魚(yú)中位生存時(shí)間分別為12.87天,7.67天,9.96天,10.35天,8.96天；總體生存率差異有顯著性(P0.001)。2.各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織TUNEL染色H/R和處理組幼魚(yú)腦組織TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞的核呈斑點(diǎn)狀棕褐色深染,形態(tài)不規(guī)則,大小不一,呈顆粒狀分布于核周或濃縮成團(tuán),另有少數(shù)細(xì)胞核呈均勻黃色淡然,TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞散在分布于正常細(xì)胞之間,越靠近中心區(qū)域越明顯。0.05ppm臭氧水復(fù)氧組和0.2ppm臭氧水復(fù)氧組細(xì)胞凋亡指數(shù)與H/R無(wú)明顯差異,0.1ppm臭氧水復(fù)氧組凋亡細(xì)胞指數(shù)明顯低于H/R,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)3.1各組幼魚(yú)腦組織總抗氧化水平變化與正常對(duì)照組相比,H/R組3h總抗氧化能力下降,差異無(wú)顯著性(P0.05),而處理組總抗氧化能力升高(P0.05),其中0.1ppm組上升最明顯。3.2各組幼魚(yú)腦組織SOD水平變化與正常對(duì)照組相比,H/R組3h SOD活力降低(P0.05),處理組SOD活力增加(P0.05),其中0.1ppm組上升最明顯。3.3各組幼魚(yú)腦組織MDA水平變化與正常對(duì)照組相比,H/R組MDA含量在3h時(shí)升高(P0.05),處理組MDA含量也升高,但與H/R組無(wú)顯著差異(P0.05)。4.各組幼魚(yú)腦組織SODmRNA表達(dá)水平變化與正常對(duì)照組相比,H/R組在3h時(shí)SOD表達(dá)下調(diào)(P0.05),各處理組在3h時(shí)SOD表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05)。[結(jié)論]1.將斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于極低氧濃度環(huán)境中可建立斑馬魚(yú)幼魚(yú)缺氧性腦損傷模型。2.缺氧可通過(guò)氧化應(yīng)激損傷斑馬魚(yú)腦組織,氧化應(yīng)激是斑馬魚(yú)缺氧性腦損傷的機(jī)制之一。3.醫(yī)用臭氧對(duì)缺氧性腦損傷的腦組織氧化應(yīng)激有抑制作用,可提高腦組織抗氧化水平,降低缺氧后腦細(xì)胞凋亡,提示醫(yī)用臭氧對(duì)缺氧性腦損傷的斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦損傷有保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 許秀珍,朱天才;神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)腦性癱瘓患兒神經(jīng)功能的修復(fù):2230例效果分析[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年07期

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本文編號(hào)：1142291