發(fā)布時間：2017-10-23 13:07

  本文關(guān)鍵詞：靶向沉默TGF-β1表達(dá)的shRNA的篩選及其對腎小管上皮細(xì)胞EMT的抑制作用

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【摘要】：背景腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)在腎臟間質(zhì)纖維化形成過程中起到重要作用。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是腎小管上皮細(xì)胞EMT過程中的重要調(diào)控因子。RNA干擾技術(shù)可以誘導(dǎo)特異性靶基因mRNA降解,從而抑制靶基因的表達(dá)。因此,篩選靶向沉默TGF-β1表達(dá)的短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)對防治腎小管-腎間質(zhì)纖維化具有重要意義。 目的篩選靶向沉默TGF-β1表達(dá)的shRNA,并探討其對腎小管EMT的抑制作用。以期為進(jìn)一步研究參與TGF-β1誘導(dǎo)腎小管-腎間質(zhì)纖維化的下游分子奠定基礎(chǔ),為利用RNA干擾技術(shù)沉默TGF-β1的表達(dá)以防治腎小管-腎間質(zhì)纖維化的可行性提供科學(xué)依據(jù)。 方法 1.覆蓋TGF-β1基因cDNA全長,設(shè)計(jì)靶向TGF-β1mRNA的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA),通過對所設(shè)計(jì)的所有siRNA進(jìn)行同源性分析篩選出5條siRNA。以篩選的5條siRNA為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)靶向TGF-β1mRNA的shRNA5條。所有shRNA的DNA序列均送公司合成并退火。 2.采用分子克隆方法構(gòu)建含TGF-β1shRNA的p-Genesil-shRNA真核表達(dá)重組質(zhì)粒(p-Genesil-shRNA1、p-Genesil-shRNA2、p-Genesil-shRNA3、p-Genesil-shRNA4和p-Genesil-shRNA5)及p-Genesil-1-shRNA-vect對照質(zhì)粒(含無關(guān)shRNA),并通過酶切和測序方法進(jìn)行鑒定。 3.以腎小管上皮細(xì)胞HKC為研究對象,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將p-Genesil-1-shRNA-vect質(zhì)粒和各重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)或高糖環(huán)境激活的HKC細(xì)胞(分別命名為：p-Genesil-1-vect細(xì)胞、p-Genesil-shRNA1細(xì)胞、p-Genesil-shRNA2細(xì)胞、p-Genesil-shRNA3細(xì)胞、p-Genesil-shRNA4細(xì)胞和p-Genesil-shRNfA5細(xì)胞),通過Western blotting方法檢測TGF-β1表達(dá)的變化,篩選可靶向沉默TGF-β1表達(dá)的shRNA。以高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-1-vect細(xì)胞為對照組,以高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-shRNA4細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,通過Western blotting方法檢測a-SMA、角蛋白、Ⅰ型膠原和波形蛋白表達(dá)的變化,觀察沉默TGF-β1表達(dá)對腎小管上皮細(xì)胞EMT的抑制作用。 結(jié)果 1.真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 酶切結(jié)果顯示,5種重組質(zhì)粒均可切出與預(yù)計(jì)相符的目的片段。測序結(jié)果顯示,所有shRNA編碼序列與設(shè)計(jì)一致,無突變、插入和丟失,方向正確。2.靶向沉默TGF-β1表達(dá)的shRNA的篩選 Western blotting結(jié)果顯示：與HKC細(xì)胞相比,高糖或Ang Ⅱ刺激的HKC細(xì)胞和p-Genesil-1-vect細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)均顯著增高(P0.05或0.01),而后二者之間TGF-β1表達(dá)差異無顯著性(P0.05)。與高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-1-vect細(xì)胞相比,高糖或Ang Ⅱ刺激的各組p-Genesil-shRNA細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)均顯著降低(P0.05或0.01)。以p-Genesil-shRNA4細(xì)胞降低最明顯。 3.沉默TGF-β1表達(dá)對腎小管EMT的抑制作用 Western blotting結(jié)果顯示,與高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-1-vect細(xì)胞相比,高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-shRNA4細(xì)胞中α-SMA、波形蛋白、Ⅰ型膠原的表達(dá)均顯著降低(P0.01),而角蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01)。 結(jié)論 1.篩選出1條尚未見報道的可靶向沉默TGF-β1表達(dá)的shRNA。 2.沉默TGF-β1的表達(dá)可抑制人腎小管上皮細(xì)胞HKC轉(zhuǎn)分化。
【關(guān)鍵詞】：腎小管-腎間質(zhì)纖維化 轉(zhuǎn)化生長因子β1 上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化 RNA干擾 短發(fā)夾RNA
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R726.9
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一部分 靶向沉默TGF-β1表達(dá)的shRNA的設(shè)計(jì)及真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定材料與方法12-20
• 1 材料與方法12-18
• 2 結(jié)果18-20
• 第二部分 靶向沉默TGF-β1表達(dá)的shRNA的篩選及其對腎小管EMT的抑制作用材料與方法20-36
• 1 材料與方法20-27
• 2 結(jié)果27-36
• 討論36-41
• 小結(jié)41-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 綜述：轉(zhuǎn)化生長因子-β1在慢性腎臟疾病進(jìn)展中的研究45-66
• 參考文獻(xiàn)54-66
• 附錄 英文縮略詞66-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況67-68
• 致謝68-69
• 個人簡歷69

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4 張q，

本文編號：1083531